2019文献汇总 | 单细胞与病毒感染
我的单细胞测序project主要是做炎症相关的单细胞转录分析，在检索paper的过程中，发现有关单细胞测序和病毒相关的文献是很少的，大致统计一下也不过十几篇，追根究底可能有两个方面的原因：
（1）我们做感染的还是很穷哒，科研界的基尼系数很高啊！（在此谢谢肿瘤学领域极力抬高了科研领域的GDP）；
（2）单细胞测序本身的限制性；虽然有些病毒，如流感病毒，它们的vmRNA也有尾部加poly A的特征，常规的scRNA-seq方法可以同时捕获病毒RNA和宿主细胞mRNA共同进行建库和测序，但由于转录表达水平较低（和宿主相比），先期不易捕获，导致利用单细胞测序病毒感染进程的起始点较为困难（一定要注意不是所有病毒都有poly A尾！）。Nature重磅综述 |关于RNA-seq，你想知道的都在这
Workflow
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上图为SaraCristinelli发表的《The use of single-cell RNA-Seq to understand virus–host interactions》中使用单细胞RNA-seq和表型分析鉴定特定细胞特征基因的简要步骤:
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（i）单细胞分离;
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（ii）RNA-Seq程序，即RNA提取，逆转录（RT），文库制备和测序;
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（iii）数据分析（单细胞教程汇总）。
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文章传送门：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625717301530?via%3Dihub#!
文献简介
关键词：病毒和宿主细胞之间的感染效应
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2019年11月，伊利诺伊州立大学研究团队利用10X单细胞转录组测序对甲型流感病毒（IAV，Influenza A virus）和宿主之间相互联系的异质性进行分析，进而观察到病毒基因表达的复杂异质性，以及在感染细胞群内存在多个不同的宿主对感染的转录反应。
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主要内容：研究人员为了研究病毒感染导致的宿主反应的异质性，并希望去掉不同病毒滴度导致的差异，于是2009 H1N1感染A549细胞时的感染复数（MOI，multiplicity of infection）为0.01，保证>99.99%的感染细胞中含有1个病毒颗粒。
10XGenomics测序发现4662个virion-infected cells，3610个bystander cells和4597个mock cells。
作者发现即使感染状态时间相同，病毒转录本层面上也均在巨大差异。
然后研究人员试图查找病毒基因和宿主转录层面的相关性，虽然发现细胞在对IAV进行宿主反应时并没有标准的转录表达，也没有发现病毒转录水平和细胞聚类存在关联性，不过发现了细胞周期相关基因如CDK1，CENPF，MKI67是导致感染细胞异质性的原因，还发现了细胞群体的异质性主要是由病毒感染和宿主细胞本身存在的异质性所引起的。
流感病毒基因组是由8股单链RNA片段组成，分别是HA、NA、M、PA、PB1、PB2、NP和NS，共编码11个病毒蛋白质，接着作者想要探究病毒基因对宿主反应的影响，发现~10%的感染细胞并没有NS片段的转录本表达，并且发现干扰素相关基因（interferon-stimulated gene，ISG）与NS片段表达高度相关。
最后，作者比较了不同感染细胞的宿主转录水平，发现在H1N1上各个细胞亚群之间的IFN和ISG表达并没有显著差异，而在H3N2上差异巨大。
该结果对于揭示病毒和宿主细胞之间的感染效应具有重要意义，其中区分不同组分之间的差异性可能为治疗感染提供借鉴。
传送门：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/858373v2.full
关键词：病毒数量和免疫反应
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2019年10月，西奈山伊坎医学院研究团队利用10× Genomics测序在单细胞水平上分析了早期感染期间IAV和人类上皮呼吸细胞相互作用的动力学。
研究人员发现，病毒的数量对宿主天然免疫影响巨大，并在原代上皮细胞感染实验中发现早期的天然免疫反应对于抑制病毒扩散的重要性。
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主要内容：研究人员首先用不同MOI值的病毒（0.2，0.6，2，10）感染A549细胞，发现MOI值越大，NS1表达时间越早，并且在每个时间点MOI值和NS1表达呈现正相关。
为了研究病毒拮抗和天然免疫反应，作者分别使用2MOI和0.2MOI进行感染，感染后细胞分为5个clusters，差异基因中细胞周期基因贡献度最大。
在后期进行进一步聚类分析时，发现较低的拮抗效应可以激发更多的干扰素的产生。
随后作者分析了在IAV感染期间上调病毒和细胞基因的转录本之间的相关性，大多数病毒片段与细胞基因的表达情况均成反比，尤其是NS片段和PA片段。在比较感染细胞和旁观者细胞时，发现感染细胞的天然免疫反应相似或者略低于旁观者细胞（如TRIM22,OAS2,IFI27等基因）。然后确定了上皮细胞中病毒感染过程中I型和III型IFN系统之间的差异表达模式，早期天然免疫反应由III型IFN主导。
在单细胞表达分析中确定的IFNL1表达模式与大量表达IFNL1的旁观者细胞中的旁分泌激活机制相一致。低MOI的IAV感染会导致旁观者细胞中抗病毒ISG的诱导，从而潜在地保护它们免受病毒感染。
本报告提供了有关感染的早期阶段后，随着感染上呼吸道上皮细胞中感染单细胞的流感病毒数量增加，IAV免疫拮抗作用与先天免疫反应相互作用的动力学变化的见解。
传送门：
https://jvi.asm.org/content/93/20/e00559-19
关键词：与感染相关的宿主细胞基因和途径
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2019年10月，萨尔大学医学院病毒学研究人员通过结合三种不同的计算方法来确定与感染相关的宿主细胞基因和途径：基因和途径离散分析，细胞状态转变概率的预测以及未来的细胞状态。该研究提供了对单纯疱疹病毒1（Herpes simplex virus-1，HSV-1）感染早期阶段的认识，并为研究病毒感染中异质细胞状态提供借鉴。
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主要内容：疱疹病毒感染在宿主细胞中引发一系列扰动，但在单个细胞的水平上仍知之甚少。为了观察病毒感染前几个小时的分子表型的异质性，研究人员使用10MOI的滴度对原代细胞（NHDFs）进行感染，并对感染后1，3，5h的细胞进行Drop-seq（Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（二）- 实验平台），通过聚类分析发现导致细胞异质性的主要因素是细胞周期和感染进程。
处于S-，G2,和M-期的细胞更容易受到病毒感染，或者病毒在该类细胞中进展更快。在裂解感染过程中，HSV病毒转录本在单个细胞中呈现双峰，其中在第一个峰中只含有1或2个病毒转录本，双峰可能是由于US1/UL54的表达和感染后期的相互转化。
研究感染后病毒基因表达的变化时，发现RASD1和RRAD与病毒转录本呈现正相关性，并通过siRNA实验发现其具有抗病毒活性。然后利用RNA velocity发现NRF2与病毒转录本呈现正相关。
最后研究人员使用两种NRF2激动剂探究调控HSV-1感染，发现早期病毒基因UL29和晚期病毒表达基因UL6均会较少，表明病毒粒子的生成和/或病毒转录/复制的晚期阶段受到影响。
该研究对于揭示病毒感染后的动力学变化以及不同病毒基因表达和宿主免疫效应的关系具有重要意义。
传送门：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-12894-z
关键词：感染期间病毒和宿主的转录异质性
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2019年5月，芝加哥大学基因组与系统生物学研究所研究团队结合了活细胞成像和单细胞RNA测序来表征原代人细胞HSV-1感染期间病毒和宿主的转录异质性。他们发现个别感染的细胞之间病毒基因表达水平的极端差异性，并表明这些细胞聚集成转录水平上不同的细胞亚群。
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主要内容：在单细胞水平上的感染是高度异质的，大多数被感染的细胞不产生或很少产生病毒后代，而一些细胞则产生数千个。
为了探究单个细胞在病毒基因表达起始状态中的基因变化情况，用滴度为2MOI的HSV-1病毒感染原代人体成纤维细胞（HDFn）。立即早期基因ICP4的起始表达在感染后1-4h达到高峰，并且在8h和11h分别达到高峰，这可能是出现二次感染的原因。
研究团队对wildtype HSV-1和无ICP0的HSV-1突变株感染细胞后进行单细胞测序，发现感染细胞之间的差异性较大，Gini系数较高（0.8 for wildtype and 0.77 for ICP0-dd）。
在探究有关细胞周期对HSV-1基因表达的影响方面，发现G2期感染的细胞不太可能启动病毒基因表达，并且细胞从病毒强迫的有丝分裂阻滞中逃逸对HSV-1感染非常有害。
抗病毒感染的起始来源于abortively infected cell的细胞亚群，并且大多数ISG在病毒低载量的细胞中高表达。在高度感染的细胞中，21个基因表达上调，GO分析（GO、GSEA富集分析一网打进）发现其与RNA转录调控相关。通过基因通路分析发现HSV-1高度感染的细胞经历了抑制胚胎和发育遗传程序的过程，包括WNT / b-catenin途径。最后研究人员发现b-catenin与感染进程高度相关，在感染过程中，b-catenin易位至细胞核并集中在病毒复制区室。
被病毒感染的单细胞在感染的各个方面均表现出变异性，从初始表型（abortive infectionVS成功表达病毒基因）开始，到病毒基因表达的时间和速度，直至宿主细胞的细胞反应。在执行按种群平均的测量时，感染细胞群中的这种异质性是有害的，但可以通过单细胞分析来解决，这为生物学过程提供新的见解。
传送门：
https://elifesciences.org/articles/46339
点评：病毒与单细胞方面的文献普遍偏少，在实验设计方面的体内实验的报道也较少，多数都是停留在细胞系的层面上，最后说一句，感染和单细胞测序结合大有可为啊，啊哈哈哈！
