CRISPR/Cas9 设计sgRNA

CRISPR/Cas9 系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统， 通过 RNA 介导特异性的切割外源遗传物质， 用以对抗入侵的病毒和质粒。利用 Cas9 来摧毁入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 系统， 可以在体外进行基因的编辑。

为了提高CRISPR/Cas9 的特异性，使用 Cas9 切口酶和一对 sgRNA，两个相近的切口造成 DNA 双链断裂， 诱导细胞发生非同源末端连接修复， 造成目的基因的突变。

利用 CRISPR/Cas9 进行基因的编辑，首先要构建有效的 sgRNA。一般地，基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序，可以被 Cas9 蛋白特异性识别并切割的 20 个 nt。 而 PAM 序列的特征为 NGG（其中 N 为任意核苷酸）

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01

****找敲除目的基因的外显子****

根据目的基因选择待敲除靶基因位点找出敲除目的基因的外显子。 首先在第一个起始密码子 ATG 之后的外显子中找出特异性高的上下游序列。以小鼠基因 Th 为例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 区，选择第二个外显子作为敲除位点。

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02

****设计成对 sgRNA 序列****

打开网站 http://crispr.mit.edu，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列。一般推荐网站设计，因为网站可以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生。当然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列。

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设计成对的 sgRNA 序列。打开 Nickase analysis，如图所示，网站会给出多组成对 sgRNA 序列，如箭头所示，并且预测可能脱靶数。

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03

****分析成对 sgRNA 序列****

打开 http://www.oligoevaluator.com，将 sgRNA 输入，点击 Calcute，得到基因分析。综合考虑 Tm（56~62）、GC content （45～60%） 及 secondary structure 来最终确定适宜的 sgRNA 序列，因此，高 score 的序列不一定是最佳序列。

如图，第一对 81 分的序列，Tm 值大于 62 度，而且存在稳定二级结构，所以并不推荐。所以应该从上述成对序列中继续寻找合适成对 sgRNA 序列。

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04

****根据找到的合适的 sgRNA 订购 oligo****

图为 U6 真核表达载体设计，Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。

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05

****关于 cas9 的几个注意事项****

1. CRISPR-cas9 最主要的要求：PAM 序列为 NGG。

2. sgRNA，即 cas9 guide RNA，是引导 cas9 蛋白在基因编辑位点进行定向切割，所以一般是 20 个碱基，不含 PAM 序列。

3. 设计的 sgRNA 一定有效吗？一般设计好的 sgRNA 会在细胞水平验证下 DNA 水平的编辑效率，通过对细胞 DNA 序列测序以及 T7EN1 酶切验证敲减效率。对于目的基因，更主要的是验证蛋白基因 mRNA 水平进行验证。

4. cas9 的相关应用：

   （1）敲减细胞，可以选择 lenti-crisprv2 系统，通过包装慢病毒，可对目的细胞进行转染，并不断药筛得到稳定敲减细胞系。

   （2）构建基因敲除编辑鼠。根据染色体修复方式又可分为 knockout 与 knockin 两种形式。