非因解读 | 玩转顶流DSP空间组技术，最大化利用病理样本快速发
DSP空间组技术助力ANCA-GN 肾小球包曼氏囊破裂机制研究
抗中性粒细胞胞浆自抗体相关肾小球肾炎（ANCA-GN）是一种坏死性新月体肾小球肾炎（GN），可导致大量蛋白尿及肾功能迅速丧失，常进展为终末期肾脏疾病，而肾小球包曼氏囊破裂是加剧该疾病进展的重要因素，而目前包曼氏囊的破裂机制仍不清楚。
为深入研究ANCA-GN肾小球包曼氏囊的破裂机制， 2022年3月中南大学湘雅二医院肾脏病研究所陈安群团队联合纽约西奈山医学院John Cijiang He团队，在《Frontiers in Immunology》（IF:7.561)杂志上发表题为“Digital Spatial Profiling of Individual Glomeruli From Patients With Anti-Neutrophil Cytoplasmic Autoantibody-Associated Glomerulonephritis”的研究性论文（图1）。本文将数字空间分析技术（DSP）作为探索性工具，对4例ANCA-GN患者和2例微小病变性肾病（MCD）患者的FFPE肾活检组织样本(样本策略)进行空间转录组（1833个免疫为环境及代谢相关基因）和蛋白组（45种免疫相关蛋白靶标）分析，通过比较疾病中不同破裂程度的肾小球包曼氏囊内基因蛋白组空间表达特征，为ANCA-GN进展的潜在发病机制提供了新见解。
图1
研究亮点
研究团队运用DSP技术，通过collagen IV和CD45对肾组织进行双重形态学标记，便于在空间层面将组织划分为肾小球新月体伴有/无包曼氏囊（Bowman`s capsule，BC）破裂，进而特异性地检测并比较这些区域中RNA和蛋白的表达情况，进而发现介导ANCA-GN进展的潜在发病机制。
研究思路
研究结果
1. 对ANCA-GN和MCD患者肾活检样本的肾小球及其周围区域进行DSP分析
研究团队选用ANCA-GN患者（n=4例）和MCD患者（n=2例）的FFPE组织样本，对1833个免疫代谢相关基因进行DSP-RNA分析，选用其中三例ANCA-GN患者的FFPE组织样本，对45种免疫相关蛋白进行DSP-蛋白组分析（图2A）。通过形态学标记指导，将肾小球划分为肾小球无明显病变(CON)，肾小球新月体形成而BC完整(BCI)，BC局灶性破裂(SBCR)和BC完全破裂(GBCR)等(图2B)。此外，部分结果将CON和BCI合并为WBCR（无BC破裂），SBCR和GBCR合并为BCR（有BC破裂）来进行呈现（图2C）。
图2
2. 经典补体通路参与ANCA-GN疾病进展
研究团队发现中性粒细胞脱颗粒和补体相关途径的基因都呈现富集效应(图3B)，并且大部分参与中性粒细胞脱粒的基因被发现表达上调（图3C）。而补体相关途径中，凝集素途径中涉及的基因无显著差异(图3D)。与MCD组相比，补体因子B (CFB)随着BC的破裂而显著升高，而其他参与补体替代途径的基因则无显著差异(图3E)。与MCD组相比，BC破裂组中参与经典补体途径的大部分基因均显著升高 (图3F)。特别是ANCA-GN患者即使BC无破裂，其肾小球中C1R和C1S的表达水平较MCD组明显升高，而BC破裂时则该表达进一步升高，这表明经典补体途径在ANCA-GN中被激活。
图3
3. SPP1信号通路参与ANCA-GN的纤维化途径
在空间转录组学分析中，研究团队发现分泌型磷蛋白1(SPP1)在WBCR组显著增加，并且在BCR 组进一步增加，表明其在 ANCA-GN 进展中发挥作用（图 4A）。CD44 作为 SPP1受体，与 SPP1 表达具有强正相关性（图 4B、C）。此外，与 MCD 组相比，WBCR 和 BCR 组的纤连蛋白（FN）和 Col1A1 的表达逐渐升高（图4E，F），并与 SPP1 呈强正相关性（图 4G，H）。同时，SPP1 与纤维化的主要调节因子 TGF-β1 呈中度正相关（图 4D）。这些结果预示了 SPP1可能在在肾小球硬化和新月体纤维化形成中的发挥关键作用。
图4
4.DSP-蛋白组分析提示细胞凋亡是导致 ANCA-GN 肾小球细胞损伤的主要途径
研究团队通过DSP-蛋白组学分析验证DSP-RNA中的发现，与 CON 组相比，BCI、SBCR 和 GBCR 组的 CD34和BCL-XL的表达逐渐下降，而PARP的表达显著增加（图5C、F）。此外，CD34 与 CD45 之间呈强负相关，提示 ANCA-GN 中白细胞浸润和内皮损伤之间存在密切关系（图5D）。同样，血管内皮生长因子A（VEGFA）也随着肾小球损伤恶化而逐渐减少（图5E）。对系列切片进行Caspase-3和CD31（内皮细胞标志物）免疫荧光共染，结果提示内皮细胞发生细胞凋亡（图5G）。综上，细胞凋亡可能是ANCA-GN中肾小球细胞损伤的主要原因。
图5
5.BC破裂时免疫细胞浸润类型不同
研究团队同时通过DSP空间转录组技术，对可能导致 BC破裂的微环境组成（炎症细胞）进行分析，从 ANCA-GN 肾脏 ROI 中的转录谱通过反卷积算法生成16 类免疫细胞亚型（图 6A），发现BC破裂组存在更多的免疫细胞浸润，其中GBCR组中免疫细胞亚群数量最多。蛋白表达谱进一步证实了 RNA 分析的结果，表明 CD8 和 CD68 可能参与 BC 破裂的早期发展，而 CD20 和CD4 可能参与进展的晚期阶段（图 6C）。同时，蛋白表达谱表明 M1型巨噬细胞主要参与BC破裂的早期阶段，而M2型巨噬细胞参与晚期阶段（图 6C）。使用iNOS（M1巨噬细胞标志物）和CD206（M2巨噬细胞标志物）进行免疫共染进一步证实了以上发现（图 6D）。
图6
文章总结
研究团队借助DSP空间组学技术来解析肾小球有/无包曼氏囊破裂的转录组和蛋白组表达谱差异，研究结果表明，经典补体途径和替代补体途径都参与了 ANCA-GN的进展，SPP1-CD44 信号轴在新月体纤维化过程中起主导作用，并且细胞凋亡可能是导致ANCA-GN肾小球细胞损伤的重要机制。
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