NEPA21技术||异质核核糖核蛋白U (HNRNPU)保护了发
细胞死亡包括细胞程序性死亡（主动死亡）、细胞凋亡和细胞坏死（被动死亡），可由多种机制引起，其中Tp53通路起着关键作用。细胞死亡介导途径的调控发生在多个阶段，包括转录、转录后和翻译后的水平。RNA剪接是一种转录后事件，根据特定的细胞环境允许包含或排除基因序列。剪接体介导RNA剪接，这是一种包含RNA(如小核核糖核蛋白和异质核核糖核蛋白(HNRNPs))和其他蛋白质的复合体。而一种介导核染色质形成的剪接体异质核核糖核蛋白HNRNPU编码异质核核糖核蛋白U在哺乳动物的发育过程中起着至关重要的作用。
HNRNPU的微缺失或点突变都会导致一系列疾病，包括早发性癫痫和严重的智力障碍、低外显性小头畸形、胼胝体薄、面部畸形和张力减退。然而，对于发育中的大脑中HNRNPU的功能还缺乏了解。近日，以色列-雷霍沃特魏兹曼科学研究所、墨尔本大学联合纽约-哥伦比亚大学基因组医学研究所，三家研究团队在国际知名科学期刊Nature Communications上发表了题为“Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRNPU) safeguards the developing mouse cortex”的文章，目的是了解HNRNPU在大脑发育中的作用。结果显示HNRNPU功能的丧失导致有丝分裂后神经元和神经祖细胞的快速死亡，后者的敏感性明显更高。此外，参与细胞存活、细胞运动和突触形成的多个基因的表达和选择性剪接在Hnrnpu条件突变后受到影响，降低剪接因子SRSF3的水平可以抑制HNRNPU功能效应的丧失，并改善神经祖细胞的生存能力和神经元迁移。最后研究人员并确定了可以部分逆转Hnrnpu突变胚胎大脑皮层结构的丢失、改善径向神经迁移缺陷和挽救培养的神经祖细胞死亡的遗传药物试剂。
为了研究HNRNPU在大脑发育中的作用，使用含条件HNRNPU等位基因的小鼠与Emx1Cre小鼠杂交。结果显示发育中小鼠的大脑表达丰富HNRNPU水平，最显著的是在脑室区(VZ)的顶端和皮质板(图1A-C’)，使用ImageStream流式细胞仪分析游离神经球中的HNRNPU(图1D、E)表明蛋白质的表达是动态的，虽然有丝分裂细胞表达高水平的HNRNPU，但蛋白质不附着在染色质上。相反，G1/S期细胞的HNRNPU信号强度降低，更好的与染色质共定位。Emx1Cre表达和Hnrnpu突变的大脑区域逐渐被忽略，而E18皮质更小，P8大脑缺乏端脑(图1F-I)。在E18，皮质的内侧区域消失了，但皮质的残余在外侧仍然可见(G, M)。这些区域表达Tbr1，但其在更深的皮层典型定位丢失了(图1K, N)。在突变体皮质中可以检测到胶质纤维酸性蛋白然而，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在皮质板上的表达减少了约40%(图1L, O, P)。经过21天，突变小鼠存活了下来，但体积变小了且所有皮质结构都基本丧失。(图1T, V)，然而，该区域表达神经元和胶质标志物的混合物(图1Q-V)。
（NEPA21 图略）
图1:HNRNPU在小鼠有丝分裂神经祖细胞中强烈表达，对大脑发育至关重要
作者使用延时显微镜观察了电转染后体外培养的皮层细胞的存活情况(图2A-M)，以更好地了解突变大脑中观察到的表型(Emx1cre/+ Hnrnpu fl/fl)。培养的细胞成像3小时(图2A-M)，在体外两天的修复(图2N-V)。Hnrnpu fl/fl胚胎大脑用双色Cre报告蛋白CAG::spotlight (CAG::SL)进行电转染，并结合无Cre、构成Cre (CAG:: NLS-Cre- GFP)、中间祖细胞Cre (Tbr2:: Cre)或有丝分裂后神经元Cre (Ta1::Cre)。CAG聚光组成性表达了一种绿色荧光蛋白，该蛋白在Cre活性被切除后，允许一种红色荧光蛋白表达。在成像期间，对照细胞中未观察到细胞死亡(图2A-C, M)。当使用Ta1启动子时，可以看到表达切除的Cre报告基因的活细胞比例更高(图2V)
图2:神经祖细胞对HNRNPU丢失高度敏感
作者从E13Hnrnpufl/fl Emx1Cre/+ (Homo)、Hnrnpufl/+ Emx1Cre/+ (Het)胚胎和对照胎鼠(WT)的皮层中生成RNA-seq文库(图3)。通过转录组学分析，以深入了解所观察到的Hnrnpu缺失病理的分子机制，结果表明，HNRNPU强烈影响基因表达。
图3：Hnrnpu突变体皮层显示了对大脑发育和功能至关重要的基因的mRNA表达和选择性剪接的变化
由于Hnrnpu的突变会导致细胞死亡，为了验证这一表型，研究人员将小鼠皮层胚胎神经祖细胞作为原代神经球培养，使用NEPA21电转仪将CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA转染到培养的神经球中，据细胞计数估计，40%的分离细胞为GFP阳性，活细胞高达90%，并使用10× Genomics©平台进行单细胞RNA-seq实验。结果显示低Hnrnpu表达的细胞TP53通路活性增加，而在同一培养物中具有高Hnrnpu表达的细胞，该通路被抑制。为了进一步验证这一发现，我们追踪了接受相同培养条件的神经球以及突变脑切片中TP53的动态稳定性(图4A-F)。通过Ingenuity分析确定的TP53调控的272个基因中的几个关键基因(图4G)并追踪了转染Hnrnpu sgRNA的神经球的功能显示了大多数已验证的与该通路相关的基因之间可能的网络连接示意图（图4H-I’）
（NEPA21 图略）
图4 :Hnrnpu KO.后TP53介导的细胞凋亡途径被激活
研究人员还研究了减少神经圈培养中观察到的细胞死亡的遗传学方法。除了通过CRISPR介导的Tp53缺失或通过含有Mdm2的外显子3的异位表达来操纵P53水平外，作者还检测了CRISPR-介导的Srsf3缺失(图5B-D)。在缺乏HNRNPU的情况下，SRSF3蛋白水平降低，Mdm2外显子3包合物的比例恢复到野生型水平，通过观察电转染后的神经球图像（图5A）发现神经球的大小进行了恢复。此外，Hnrnpu的缺失影响了与细胞迁移和运动以及细胞骨架有关的基因，这些基因都对正常的神经元迁移至关重要(图3B)。研究人员并在小鼠子宫内电转染法检测了Hnrnpu缺失对神经元迁移的影响,小鼠妊娠14天后进行麻醉，暴露子宫口，用口吸管通过子宫，通过拉动的玻璃毛细血管将与Fast Green（2μg/μl；Sigma）混合的质粒微量注射到胚胎的侧脑室。通过NepaGene公司电转仪器NEPA21产生的5个脉冲放电程序来完成电转染，脉冲通过位于每个胚胎头部两侧的直径为10毫米的镀铂镊子电极通过子宫传递。结果发现在子宫内植入Hnrnpu sgRNA可有效降低Hnrnpu蛋白水平，RNA剪接的调节可以逆转由HNRNPU功能丧失导致细胞活力的受损和神经元迁移。
图5：Srsf3下调补偿了HNRNPU的活性损失
最后，研究人员通过重点研究TP53通路在体外培养祖细胞死亡和皮层结构完全丢失中的作用，HNRNPU和SRSF3的减少会影响多个基因的表达和剪接导致了TP53上游调控因子的改变，从而激活该通路导致细胞坏死。应用不同的细胞死亡抑制剂(例如Caspase, TP53坏死抑制剂)挽救了神经球的生长，增加祖细胞增殖，并部分恢复层标记物的表达使得大脑皮层表现出了更完善的组织结构，并显著改善了中心体同化。总之，数据表明HNRNPU调节剪接，对大脑的发育至关重要。
在本研究中，作者使用了免疫组学、转录组学、神经球制备及电转染、子宫内电转染、成像流式细胞术、构建MARS-seq文库和单细胞RNA-seq等方法才使得实验顺利完成。
本实验中，研究人员借助NEPA21卓越的基因导入功能完成了CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA导入到小鼠皮质层培养的神经球以及子宫内发育中的胚胎大脑中，从而验证了Hnrnpu的突变会导致细胞死亡的这一表型，全新电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式，同时细胞计数表明转染效果好，细胞的存活率高。
NEPA21专利电压衰减（Voltage Decay）设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵以及宫内胚胎等转染。
论文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-022-31752-z
参考文献
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6、百度百科（baidu.com）
