生信分析 Nature综述|单细胞多组学揭示肿瘤进化的决定因素
Hello，大家好呀，我们又见面了，新的一年从好文献开始！今天介绍一篇2020年8月17日发表于Nature Reviews Genetics 的综述性文章，题目为“Integrating genetic and non-genetic determinantsof cancer evolution by single-cell multi-omics”，文中讨论了应用单细胞多组学技术并整合多种数据模式，可以为癌症进化研究提供信息，表明癌症是由于体细胞进化的遗传决定因素和非遗传决定因素之间复杂的相互作用所致。在癌症的进化过程中，不断增殖的恶性细胞亚群出现遗传多样化，从而导致肿瘤进展，复发和获得对治疗的抵抗力。除了遗传多样性外，促进进化选择的细胞间差异还表现在细胞状态，表观遗传概况，空间分布以及与微环境的相互作用。因此，对癌症的研究需要在单个细胞的分辨率上并整合多个可遗传的维度。
引言
癌症的进化史包括恶性转化，然后进展为更具侵略性和耐药性的细胞群体，最终导致临床表现的加重。体细胞突变，包括单核苷酸变异（SNV）和结构变异，对于癌症的发生和发展至关重要。然而，近年来，已经在健康组织中发现了普遍的体细胞突变，特别是那些暴露于环境致癌物（例如皮肤和食管）的组织突变，都表明癌症通常是由恶性前的克隆产物所引起。重要的是，克隆生长中的体细胞突变没有进展，甚至没有退化，与癌症的复发驱动因素重叠。由此表明，仅遗传机制可能不足以驱动恶性转化。通过单个细胞多组学整合单个癌细胞的多层信息对于全面理解癌症进化的机制至关重要（图1）。
图 1.单细胞多组学用于解密癌症中的克隆进化
遗传异质性和谱系追踪
（1）bulk seq中克隆结构的推断
通过持续获取体细胞突变而产生的遗传异质性是许多癌症克隆进化的基础。这些遗传异质种群的克隆结构可以通过下一代测序进行推断。全基因组或全基因组测序（WGS）数据中体细胞突变的读取深度和变异等位基因频率可用于推断每个突变的肿瘤纯度，倍性和局部拷贝数，从而确定包含突变的癌细胞比例（ CCF）。这些数据可以在一定程度上解决克隆和亚克隆的关系（图2a）。在非整倍体实体瘤中，WGS可以通过确定SNV是在大型扩增过程（如全基因组复制）之前还是之后发生，来帮助比较克隆体细胞的早期或晚期变化。
图 2.系统发育推断
当应用于大型队列时，这些分析提供了驱动序列发生突变的进化序列蓝图。其中，驱动程序事件可以分为早期，通常是祖先的突变（例如，髓系肿瘤中的DNMT3A和TET2突变），而晚期亚克隆驱动程序则是由于恶性细胞群（例如SF3B1，TP53和NPM1）的持续选择而产生的淋巴和骨髓恶性肿瘤的突变。同样，在大量的肾细胞癌队列中，可以将肿瘤分为不同的进化亚型（例如，PBRM1中具有驱动事件的肿瘤，随后在SETD2或PI3K中发生改变），这些可能与预后信息相关（例如，“ PBRM1→SETD2”或“PBRM1→PI3K”亚型，病程发生减弱）。因此，时序分析已绘制出癌症中不同的进化轨迹或优选的突变序列，表明优化路径和突变的相互依赖性。虽然亚克隆驱动程序的存在预示着癌症患者的临床结局较差，但提前诊断可能会提供早期干预的机会（图2a）。
（2）通过多重采样定义克隆动态
癌症进化是一个动态过程，，适应性不同的克隆可能会重塑肿瘤的基因组成。由于CCF随时间变化，在克隆进化过程中的不同时间点进行多次采样可以为CCF低的亚克隆提供更高分辨率（图2b）。对于实体恶性肿瘤中循环的白血病细胞或循环肿瘤DNA的密集时间采样，可以通过数学建模来测量与治疗有关的克隆生长动力学。例如，与治疗前的肿瘤相比，化疗后复发的慢性淋巴细胞性白血病（CLL）TP53突变的CCF升高，表明面对治疗，TP53突变的亚克隆具有更大的适应性优势。多重采样的另一种形式是在肿瘤内的多个区域进行采样，以评估肿瘤内克隆的空间组成，并有助于改善克隆关系，从而改善临床分层。微卫星的高变异性也可以用于谱系追踪，尤其对于转移性疾病的分析可以进一步阐明克隆扩散的模式，并可以推断出肿瘤进化的迁移模式。
（3）追踪单细胞的遗传史
尽管多重采样有助于癌症进化过程中的克隆解构，但仍需要以单细胞分辨率解析系统发育才能得出精确的克隆动力学和肿瘤的进化史。（图2c）使用基于液滴的微流控平台进行的高通量，单细胞靶向DNA测序，可检测一组反复出现的驱动程序突变，从而高度灵敏地捕获成千上万个细胞的体细胞基因型，以揭示急性期从诊断到复发的亚克隆转变髓细胞白血病（AML）。直接应用于人类癌症的回顾性谱系追踪推断的另一种方法是单细胞WGS（scWGS）。 scWGS可以推断出用作天然条形码的CNA，通过该条形码可以得出各个细胞之间的系统发育关系。
图 3.谱系追踪
肿瘤进化过程中细胞状态的异质性
（1）细胞状态的可塑性作为癌症进化的媒介
肿瘤内的遗传变异性是肿瘤异质性的基础，在提供可遗传多样性的同时，可以驱动整个癌症的克隆进化。然而，仅遗传机制可能无法捕获整个肿瘤内异质性。长期以来人们就认识到这样的变异性是单个肿瘤内细胞状态的可塑性。一个经典的例子是上皮组织源性癌症中的上皮-间质转化（EMT），让人联想到胚胎发育过程中上皮和间充质细胞之间的转化。EMT是一种具有中间或部分EMT的异构动态分布，它由复杂的转录因子网络控制，例如SNAI1，SNAI2，ZEB1，TWIST1和其他调控因子。在癌症的分层模型中，将细胞分为干细胞性和分化细胞性。肿瘤干细胞处于肿瘤分化等级的最高峰，反映了正常干细胞的特性，例如广泛的增殖和自我更新能力。数据表明，体细胞突变与干性状态协同作用可以引发癌症。
（2）单细胞分辨率下转录状态的异质性
由于转录状态的异质性是肿瘤起始和进展的关键因素，因此，来自原发肿瘤的单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为一种转化技术。不同癌症类型的研究表明，肿瘤内细胞状态的异质性具有普遍性。细胞状态的异质性不仅归因于基本的细胞过程，例如细胞周期，代谢和低氧诱导的应激状态，还归因于发育程序和临床相关的抗性。scRNA-seq可以区分非肿瘤细胞中的稀有肿瘤细胞，以进行早期疾病检测或最小程度的残留疾病检测，并确定可靶向的耐药性程序。scRNA-seq不仅可以在给定的时间内测量细胞状态，而且可以预测细胞状态动态。基于转录数据中相似性梯度的推断，出现了各种方法来重建分化轨迹，统称为伪时间投影分析。例如，这些技术中的第一个技术Monocle可以构建最小的生成树，以构建将单个细胞映射到其主干上。另一个独特的方法通过量化标准scRNA-seq中未剪接的与剪接的mRNA的比例来确定“ RNA速度”，即mRNA丰度的变化率，来预测未来的细胞状态。
（3）遗传谱系与单细胞转录状态的耦合追溯具有明显表型变异（例如，沿着发育层次或治疗耐受性）的癌细胞谱系，需要将遗传信息与scRNAseq数据整合起来。由于在单细胞测序技术中Smart-seq2通量较低，在体细胞基因分型效率方面也很低，因此基于高通量液滴的scRNA-seq（10x）中也进行了SNV的检测，每个细胞至少约20,000reads。
图4.体细胞突变重塑了分化拓扑
作为一种替代方法，作者开发了转录组基因分型（GoT），可修饰基于液滴的scRNA-seq（10xGenomics）。 GoT能够在数千个细胞中进行高度敏感的基因分型，导致CALR驱动程序基因中主要的体细胞突变靶标的基因分型效率约为90％。
癌症进化中的表观遗传可塑性
（1）表观遗传学基础是细胞状态
上述的致癌特性，如持久性，自我更新和谱系可塑性，需要通过遗传以促进癌症向进展和抵抗的方向进行演变。越来越多的数据表明，细胞状态可以表观遗传地编码和增殖，这与正常发育生物学中细胞身份的表观遗传编码相一致。表观遗传学包括DNA甲基化（DNAme），染色质可塑性和组蛋白修饰，主要通过关键转录因子来介导。总体而言，表观遗传修饰导致转录活性的高度协调调节，这对于正常发育极为重要。在癌症中，血液肿瘤中表观遗传修饰因子（如TET2，DNMT3A和ASXL1）和实体肿瘤中SWI /SNF（BAF）染色质重塑复合体的突变普遍存在，这表明表观遗传学在介导肿瘤发生中具有重要意义。此外，最近研究指出表观遗传学是持久性和抗性的潜在转录特征。在胶质母细胞瘤中，持续存在的肿瘤干细胞显示出抑制性组蛋白甲基化（H3K27me3）的整体重构，并且与Notch信号传导和静止相关的活性增强子标记基因（H3K27ac）表达水平升高。在雌激素受体阳性的乳腺癌中，KDM5组蛋白脱甲基酶的表达增强了转录异质性和耐药性。因此，越来越多的证据表明表观遗传编码对癌症细胞状态的重要性。
（2）受损的表观遗传特性影响肿瘤可塑性
正如基因组中的随机错误导致遗传内肿瘤异质性一样，表观基因组中的随机突变也会产生表观遗传的瘤内多样性。这些基于大量亚硫酸氢盐测序的研究表明，成千上万个位点表现出DNAme变化的“嘈杂”随机模式，代表了正常和癌性体细胞表观基因组中可遗传的细胞间差异。对原发癌组织的检查表明，肿瘤细胞表现出与基因进化平行的DNAme多样化。在前列腺腺癌的原发肿瘤，转移灶和恶变前生长的多个区域进行的采样显示，可以通过DNAme异质性进行的谱系追踪密切反映基于拷贝数遗传多样性建立的系统发育关系。同样，在结直肠癌模型中，对单细胞来源的结肠癌类器官的DNAme分析显示，DNAme异质性可以稳定传播。对原代CLL样本中DNAme的大规模分析证实，肿瘤内DNAme的异质性高于正常B细胞，并预示了不良结局。
图5. 癌症进展的综合模型
空间动力学与微环境
空间定位代表与适应性相关的肿瘤细胞进化的另一个可遗传的维度，因为肿瘤细胞倾向于在空间受限的生长中与其亲本细胞共定位。例如，在某些情况下，实体瘤块前沿的细胞处于活跃的细胞周期（“边界约束”生长），这表明空间限制是与转移潜力和生存有关的重要的可遗传性特征。最新数据表明，肿瘤细胞的空间分布不仅与适应性有关，而且与克隆进化有关。与同一大小的恶性前腺瘤形成鲜明对比的是，同一肿瘤内单个腺体（由<10,000个细胞组成）的多区域采样进一步揭示了结直肠癌中的高度克隆混合。（图5）。研究表明微环境正在对亚克隆施加选择性压力，并积极推动癌症的进展。
单细胞分辨率下的肿瘤微环境
尽管上述对原发癌样品的大量多组学分析为微环境对进化过程的影响提供了有力的支持，但微环境的细胞复杂性需要单细胞分析来提供与肿瘤相互作用的高分辨率图谱。例如在头颈部鳞状细胞癌中，通过scRNA-seq鉴定了具有部分EMT程序的肿瘤细胞与基质室之间的相互作用。
结论
癌症进化包括遗传，细胞状态，表观遗传，空间和微环境因素的复杂相互作用。最近，多组学技术已开始在单个细胞的关键分辨率（基本进化单位）上整合肿瘤进化的这些遗传和非遗传决定因素。单细胞多组学应用于人体组织的进化将为基本系统特性提供关键线索。
参考文献
Nam, A.S., Chaligne, R. & Landau, D.A. Integrating genetic and non-genetic determinants ofcancer evolution by single-cell multi-omics. Nat Rev Genet 22, 3–18 (2021). https://doi.org/10.1038/s41576-020-0265-5
