2018-12-31

1.细胞培养：B16F10和CD8+T细胞

2.慢病毒Cas9-Blast与pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G质粒共转染到HEK293T细胞中，然后收割病毒滴定后储存。该步的目的是对慢病毒Cas9-Blast进行包装，得到能够将目的序列稳定插入到宿主细胞中的病毒颗粒该病毒颗粒用于感染宿主细胞B16F10。

3.将慢病毒Cas9-Blast感染B16F10后使用杀稻瘟菌素进行筛选，得到稳定的带有Cas9的细胞，即B16F10-Cas9

4.目的：为了获得高Cas9活性的克隆

B16F10-Cas细胞以单细胞分选入96孔板并用慢病毒感染，驱动Cd274和荧光探针特异性的gRNA的表达。感染10天后，将每个单独的克隆用γIFN刺激，并使用抗-CD274抗体通过FACS测定PD-L1的表达。通过测量转导的（mCherry）群体中PD-L1阴性细胞的百分比来评估Cas9编辑效率。

5.（1）对T细胞介导的细胞毒性具有抗性的阳性对照：B16F10-Cas B2m缺陷（B2m缺失导致MHCⅠ类分子折叠异常从而对免疫检查点抑制剂耐药）

    （2）对T细胞介导的细胞毒性敏感的阳性对照：B16F10-Cas-cd274缺失（cd274编码PD-L1，它的缺失导致免疫检查点破坏，无法产生免疫耐受，导致细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感）

6.将（1）和（2）分别与亲本B16F10-Cas细胞共培养，得到的产物与与体外活化的OT-I或Pmel-1CD8 T细胞共培养。为了用OT-I T细胞进行筛选，在与T细胞共培养之前，用Ova（SIINFEKL）肽在37℃下脉冲B16F10细胞2小时。为了被Pmel-1T细胞最佳杀伤，在与T细胞共培养之前，用IFNγ预处理B16F10细胞24小时以增强表面MHCI类表达（在不存在IFNγ时非常低）。筛选1-3天后，将肿瘤细胞从平板上分离，并且在对DAPI-CD45-CD3-群体进行门控后通过FACS测定B2m-/-（GFP+）和Cd274-/-（mCherry+）细胞的百分比。通过比较选择前和之后阳性对照细胞与亲代细胞的比例来计算倍数富集和消耗。

6得到的结果图为：纵坐标表示Cd274-/-缺陷型细胞的mCherry+荧光强度，横坐标表示B2m-/-缺陷型细胞的GFP荧光强度。从A中可以看到在T细胞筛选之前和之后Cd274-/-缺陷型细胞的荧光强度减弱，而B2m-/-缺陷型细胞的荧光强调度没有明显变化，这说明了在T细胞处理Cd274-/-缺陷型细胞和B2m-/-缺陷型细胞之后，Cd274-/-缺陷型细胞大部分被T细胞杀死，而B2m-/-缺陷型细胞对T细胞杀伤具有抗性。

7.CRISPR Brie慢病毒和质粒psPAX2和pCMV-VSV-G共转染到HEK293T细胞中并收割病毒储存于-80℃。目的是对CRISPR Brie慢病毒进行包装，得到将目的序列稳定插入到宿主细胞中的病毒颗粒该病毒颗粒用于感染宿主细胞B16F10-Cas细胞中。

8.将7中收割的病毒感染靶细胞B16F10-Cas，并用嘌呤霉素筛选被CRISPR Brie慢病毒稳定感染的细胞系，测定滴度后计算sRNA的感染率。

9.Pmel-1筛选：B16F10-Cas9（克隆4）细胞用MOI为0.06的“Brie”慢病毒感染，在Pmel-1筛选之前，B16F10细胞铺板，①用于基因组分离提取，②对照组：与OT-1T细胞共培养（未使用OVA脉冲），③实验组：与Pｍel-1共培养。与T细胞共培养之后移去T细胞后再生的细胞表示对T细胞具有抗性的细胞，将再生的细胞挂下，使用gRNA试剂盒PCR扩增，然后对gRNA 的表现度进行Illumina测序。

10.OT-I筛选：B16F10铺板：①用于基因组分离提取，②对照组：与OT-1T细胞共培养（未使用SIINFEKL脉冲），③实验组：与OT-IT细胞共培养（使用SIINFEKL脉冲）。与T细胞共培养之后移去T细胞后再生的细胞表示对T细胞具有抗性的细胞，将再生的细胞挂下，使用gRNA试剂盒PCR扩增，然后对gRNA 的表现度进行Illumina测序。