易基因｜m6A去甲基化酶ALKBH5通过降低PHF20 mRNA
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2022年8月17日，北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授课题组在《Clin Transl Med》杂志发表了《N6‐methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation》的研究论文，该研究通过MeRIP-seq等技术揭示ALKBH5可能通过降低PHF20 mRNA甲基化来抑制结直肠癌进展。
标题：N6‐methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation
时间：2022.08.17
期刊：CLINICAL AND TRANSLATIONAL MEDICINE
影响因子：IF 8.554
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、mRNA-seq
样本：
MeRIP-seq：6个CRC患者肿瘤组织（实验组）+ 6个肿瘤附近正常组织（对照组）
RNA-seq：2个ALKBH5敲除的LOVO细胞系 + 2个对照细胞系
研究思路：
背景意义：
作为最常见的恶性肿瘤之一，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率居全球第三位，死亡率居全球第二位。尽管结直肠癌 (CRC) 的综合治疗方法有所改进，但其预后仍然很差。结直肠癌进展的分子机制有待进一步探讨。
作为最广泛的mRNA 修饰，N6-甲基腺苷 (m6A) 受到甲基转移酶和去甲基化酶的动态可逆调节。ALKBH5 是一种主要的去甲基化酶，在癌症的进展中起着至关重要的作用。然而，ALKBH5在结直肠癌 (CRC) 中的作用和机制尚不清楚。
研究图形摘要
研究亮点：
（1）ALKBH5在CRC中表达下调，并发挥关键的肿瘤抑制作用。
（2）ALKBH5通过敲除m6A修饰抑制PHF20 mRNA的稳定性。
（3）靶向ALKBH5介导的PHF20
mRNA m6A修饰可能是一种有前途的CRC干预和治疗策略。
结果图形
（1）ALKBH5在CRC中表达下调
图1：ALKBH5在结直肠癌（CRC）中表达下调
A. 癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库中23种实体癌中的ALKBH5 mRNA表达。
B. 基因表达综合 (GEO) 数据库中CRC的ALKBH5 mRNA 表达。
C. 24 对 CRC 肿瘤和邻近正常组织中ALKBH5 mRNA 表达的RT-qPCR分析。
D. CRC肿瘤和配对正常组织中 ALKBH5 表达的代表性免疫组织化学染色 (IHC) 图像。
E. CRC肿瘤组织 ( n= 114) 和邻近正常组织 ( n= 107)中ALKBH5的IHC评分量化。
F. CRC肿瘤组织和邻近正常组织中的N6-甲基腺苷(m6A)mRNA水平的相对定量分析。
（2）ALKBH5缺失预示CRC患者的预后更差
表1：根据ALKBH5 mRNA水平分析130名结直肠癌 (CRC) 患者的临床特征
表2：根据ALKBH5蛋白水平分析114名结直肠癌
(CRC) 患者的临床特征
图2：ALKBH5 缺失预示CRC患者的预后更差
A. ALKBH5 mRNA表达与转移 (M) 阶段之间的关系。
B. ALKBH5 mRNA表达与AJCC阶段之间的关系。
C. 基于ALKBH5 mRNA表达的CRC患者总生存期 (OS) 的 Kaplan-Meier 分析。
D. ALKBH5蛋白表达与M期的关系。
E. ALKBH5 蛋白表达与 AJCC 阶段之间的关系。
F. 基于ALKBH5 蛋白表达的CRC患者OS的 Kaplan-Meier分析。
（3）敲低ALKBH5可促进结肠癌细胞的生长和转移
图3：敲低ALKBH5增强了体外结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
(A) 五个结肠癌细胞中的ALKBH5 mRNA 表达。
(B 和C) 用3种独立的靶向ALKBH5的siRNA感染的LOVO
( B )和RKO ( C )细胞系中ALKBH5 mRNA的表达。
(D 和E) 用2种独立的ALKBH5敲低慢病毒感染的LOVO ( D )和RKO ( E )细胞系中ALKBH5 mRNA的表达。
(F) 用2种独立的ALKBH5 敲低慢病毒感染的 LOVO 和 RKO 中的 ALKBH5 蛋白的表达。
(G 和H) 通过 CCK8 (G) 和克隆形成 (H) 实验测定 ALKBH5 敲低的LOVO 和 RKO 细胞系的增殖能力。
(I 和J) 通过Transwell实验测定ALKBH5敲低的LOVO和RKO细胞系的迁移( I )和侵袭( J )能力。
（4）ALKBH5过表达抑制结肠癌细胞生长和转移
图5：ALKBH5过表达抑制体外结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
(A 和B) 用 ALKBH5 过表达或对照载体慢病毒感染的 LOVO (A) 和 RKO (B) 细胞系中的 ALKBH5 mRNA 的表达。
(C) 用 ALKBH5 过表达或对照载体慢病毒感染的 LOVO 和 RKO 细胞系中的ALKBH5 蛋白的表达。
(D 和E) 通过 CCK8 (D) 和克隆形成 (E) 实验测定 ALKBH5 敲低的LOVO和 RKO 细胞系的增殖能力。
(F 和G) 通过transwell 实验测定ALKBH5 敲低的LOVO 和 RKO细胞系的迁移 (F) 和侵袭 (G) 能力。
图6：ALKBH5过表达抑制体内结肠癌细胞的增殖
(A 和B) 肿瘤异种移植模型是使用ALKBH5过表达LOVO细胞构建的( n= 5)。
(C) 每 2 天监测一次肿瘤异种移植模型中的肿瘤大小和形成。
(D) 肿瘤重量是从处死的小鼠身上测量的。
（5）ALKBH5靶向PHF20
图7：PHF20是ALKBH5介导的m6A修饰的下游靶点
(A) 肿瘤组织和肿瘤邻近正常组织的 MeRIP-seq 结果显示了6名结直肠癌 (CRC) 患者中变化的m6A peak分布。
(B) 六对肿瘤组织和肿瘤邻近正常组织中的 ALKBH5 mRNA 的表达。
(C 和 D）RNA-seq 中ALKBH5 敲低细胞系与对照细胞系的差异表达基因火山图（C）和热图（D）。
(E) MeRIP-seq和 RNA-seq 数据的联合分析。
(F) 与对照组相比，ALKBH5 敲低细胞系中上调基因的验证。
(G) 与对照组相比，ALKBH5 敲低细胞系中下调基因的验证。
(H) ALKBH5与癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库中的六个候选基因（CCDC69、LITAF、TGFB1I1、PHF20、PLIN3和PCSK7 ）之间的关系。
(I) PHF20在 ALKBH5 敲低细胞系和对照细胞系中的蛋白表达。
(J) CRC中的PHF20 mRNA的代表性m6A peak。
（6）ALKBH5缺失增强PHF20 mRNA的稳定性以促进CRC进展
图8：ALKBH5通过降低PHF20mRNA甲基化来抑制结直肠癌（CRC）进展
(A) ALKBH5敲低细胞系和对照细胞系中mRNA 的整体m6A水平的相对定量分析。
(B) MeRIP-qPCR分析ALKBH5 敲低细胞系和对照细胞系中 PHF20 mRNA的m6A 水平的变化。
(C) 包含m6A motif或m6A突变(A–T突变)位点的人类 PHF20 3'UTR的荧光素酶报告载体构建。黑色代表A，红色代表 T。
(D) 共转染含有野生型或突变型PHF20 3'UTR的质粒和含有siNC或siALKBH5的siRNA的293T细胞系的相对荧光素酶活性。
(E) RT‐qPCR分析ALKBH5被抑制后，放线菌素D ( 5μg / ml )处理LOVO或RKO细胞系后PHF20 mRNA的衰减率。
(F)–(I) 挽救实验用于确定ALKBH5是否通过调节PHF20对LOVO和RKO细胞系的增殖(F和G)、迁移(H)和侵袭(I)产生影响。
结论：
本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq技术，确定了ALKBH5表达在CRC中下调，同时其发挥重要的肿瘤抑制作用。从机制上讲，ALKBH5通过去除m6A修饰来抑制PHF20
mRNA的稳定性。该研究为ALKBH5介导的m6A修饰的抗癌作用提供了新的见解，同时也表明了靶向PHF20 mRNA的ALKBH5介导的m6A修饰可能是干预和治疗CRC的一个有希望的策略。
参考文献：
ZhangZ, Wang L, Zhao L, Wang Q, Yang C, Zhang M, Wang B, Jiang K, Ye Y, Wang S, ShenZ. N6-methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancerprogression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation. Clin Transl Med.2022 Aug;12(8):e940.
