P8-单细胞+外泌体蛋白组学||T细胞来源外泌体蛋白ECP参与系

T细胞在系统性红斑狼疮(SLE)的发病机制中起着关键作用。血清来源的外泌体在SLE患者中增加，并与疾病的严重程度相关。本研究旨在探讨T细胞来源的外泌体蛋白是否在SLE发病机制中发挥作用。

文献信息

• 标题：Induction of Interferon-γ and Tissue Inflammation by Overexpression of Eosinophil Cationic Protein in T Cells and Exosomes
• 中文标题：T细胞和外泌体中的嗜酸性粒细胞阳离子ECP蛋白过表达诱导干扰素-γ和组织炎症
• DOI(url): 10.1002/art.41920
• 日期及杂志：January 2022, Arthritis & Rheumatology
• 作者及单位： Tse-Hua Tan 国家卫生研究所，Zhunan，台湾 和贝勒医学院，休斯顿，德克萨斯州

数据与方法

单细胞数据分析

• 样本来源：从野生型和lck-ecp转基因小鼠的脾脏和淋巴结中纯化小鼠T细胞
• 测序平台：BD Rhapsody Single-Cell Analysis System
• 分析软件：BD SeqGeq software (BD Biosciences) and the R package Seurat

数据没有公开

外泌体组学数据分析

• 样本类型：小鼠的脾脏、淋巴结或外周血分离离纯的T细胞
• T cell–derived exosomes： LC-MS/MS analyses
• 蛋白数据搜库：Mascot MS/MS Ion Search

主要结果

SLE患者T细胞来源的外泌体中CD9和CD63表面标记物的鉴定

T细胞分泌的外泌体来源如下：系统性红斑狼疮(SLE)与健康对照患者的外周血，提取T细胞，细胞培养上清，提取外泌体

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外泌体定性分析： 使用MACSPlex assays进行外泌体marker鉴定，37个单独的表面标记物抗体与荧光珠结合

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与健康对照组(n=12)相比，来自SLE患者的T细胞上清液中T细胞来源的外泌体数量显著增加，在37例表面蛋白中，有16例外泌体表面蛋白增加。

SLE患者中T细胞来源的CD9+、CD63+、CD62P+和CD45+外泌体的数量较高（>信号为20%），且与健康对照组相比显著增加。

其中：CD9和CD63是两种众所周知的外泌体表面标记物。与对照组相比，T细胞来源的CD9+和CD63+外泌体在SLE患者中具有最高的倍数诱导率。

来自SLE患者的T细胞来源的外泌体中存在ECP

为了表征来自SLE患者的T细胞来源的外泌体特性，我们采用基于质谱的蛋白质组学分析了从SLE患者和健康对照中分离的T细胞来源的CD9+和CD63+外泌体。

• 蛋白质组学数据：在SLE患者的T细胞来源CD9+外泌体和CD63+外泌体中分别有130个和140个蛋白过表达，而在健康对照组中没有过表达
• 只有15例CD9+外泌体蛋白和21例CD63+外泌体蛋白在SLE患者中选择性富集，而在RA（类风湿性关节炎）患者中没有选择性富集

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值得注意的是，在质谱分析中在所有5例SLE患者样本的T细胞外泌体中检测到一种蛋白得分最高的外泌体蛋白ECP：

• 嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP，也称人RNaseIII)

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这个蛋白也在SLE患者T细胞中高表达，但是与正常组相比，在SLE患者血清中表达没有增加：

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以上结果表明：T细胞来源的外泌体ECP可能是SLE的一种生物标志物。因此，我们选择了富含SLE T细胞外泌体蛋白ECP来进行进一步的鉴定。

后续的分析都是围绕ECP这个蛋白进行展开的工作了

实验验证ECP蛋白在SLE发病机制中的作用

为了研究富含SLE的外泌体ECP是否在SLE的发病机制中发挥重要作用，作者构建了一个lck-ECP转基因小鼠模型并进行了表征：

• 首先，作者成功地让ECP在来自lck-ECP转基因小鼠的T细胞和T细胞来源的外泌体中过表达（图A）
• 4周龄的lck-ecp转基因小鼠在胸腺和骨髓中显示出正常的T细胞和B细胞发育，
• lck - ecp转基因小鼠外周血CD4+细胞数量轻度增加，CD8+细胞数量减少

为了研究T细胞中ECP的过表达是否会导致小鼠的炎症反应，作者监测了小鼠的血清细胞因子水平:

• 与野生型小鼠相比，2个月大的lck-ecp转基因小鼠自发地产生了血清中促炎细胞因子IFNγ水平的升高（图C）
• 2月龄lck - ecp转基因小鼠血清中TNF、IL-1β和IL-6水平未见明显升高，而8月龄lck - ecp转基因小鼠血清中IL-1β和TNF水平较同期野生型小鼠升高(P = 0.076和P = 0.056)（图C）
• 10个月大的lck - ecp转基因小鼠肝、肾、关节均有严重的炎症反应（图D）
• 血清肌酐和甘油三酯水平的升高也提示了lck - ecp转基因小鼠肾炎和肝炎的发生（图E）

为了研究含ECP的外泌体是否渗入肝和肾的炎症组织，从小鼠组织样本中分离外泌体并进行免疫印迹。验证了lck - ecp转基因小鼠组织中存在ecp阳性外泌体（图F）

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随后，作者发现从lck - ecp转基因小鼠过继转移T细胞来源的外泌体后，受体小鼠发生了炎症反应，这个结果说明：T细胞来源的外泌体ECP有助于炎症反应。

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随后，为了了解驱动lck - ecp转基因小鼠自发炎症反应的潜在T细胞反应，从8个月大的lck - ecp转基因小鼠中分离T细胞并进行单细胞RNA测序

来自Lck-ECP和野生型小鼠的T细胞根据基因表达分为11个不同的聚类，分群聚类结果如下图：

• 在T细胞中ECP过表达导致初始CD8+T细胞数量减少（cluster 3），效应CD8+T细胞数量增加（cluster 4），记忆性CD4+T细胞数量增加（cluster 2）
• 在lck-ecp转基因小鼠T细胞中，CD28和CD69等51个基因的表达水平显著上调(>1.166倍；P<0.05)(图B)
• cluster 2和4在Lck-ECP转基因小鼠T细胞中增强(图5A)，两个cluster都显示了T细胞激活和炎症特征
• 与野生型小鼠T细胞相比，GH是lck-ecp转基因小鼠T细胞中上调最多的基因（图B）

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KEGG通路分析显示，在lck-ecp转基因小鼠T细胞中上调的51个基因分别属于TNF/NFκB信号通路、IL-2/STAT5信号通路、T细胞激活和炎症反应：

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这些结果表明，ECP在T细胞中过表达可诱导T细胞活化和炎症反应

lck-ecp转基因的小鼠T细胞显示了IL-21、CXCR5和诱导共刺激因子的mRNA的显著增加(图D)，这些都是Tfh细胞的标记物

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接着，作者把目光转向了Tfh细胞。

为了研究lck-ecp转基因小鼠的Tfh细胞数量是否增加，采用流式细胞术分析小鼠脾细胞和骨髓细胞。

• 结果发现，与野生型小鼠相比，8周龄的lckecp转基因小鼠中CD4+IL-21+T细胞和CD4+CXCR5+T细胞的百分比均有所增加；这2个T细胞亚群在16周龄小鼠中进一步增强（图A）
• 与野生型小鼠相比，16周龄lck-8周龄ecp转基因小鼠脾脏中成熟B细胞(B220+CD21+)的百分比增加，而幼稚B细胞(B220+CD23+)的百分比降低（图B）
• 在8周龄的lck-ecp转基因小鼠的骨髓中，血浆B细胞的百分比(B220lowCD138+)略有增加，而在16周龄的lck-ecp转基因小鼠的骨髓中则进一步增加（图C）

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这些发现表明，在lck-ecp转基因小鼠中诱导Tfh细胞可导致血浆B细胞数量的增加，从而促进随后的自身抗体的产生。

小结

总的来说，作者首先就有自己关注的细胞亚群T细胞，直接研究了T细胞培养上清外泌体，提取外泌体做了蛋白组学分析，发现一个T细胞外泌体蛋白ECP，随后采用转基因小鼠模型对ECP在SLE患者中的作用机制进行了研究与验证，这个过程中使用了单细胞技术与流式细胞术，与一般的单细胞与外泌体联合分析思路有些不一样~