1.项目说明

采用同源模建方法构建单链抗体（以下简称“抗体”）的三维结构，通过分子对接方法预测化合物的结合模式（图 1）。

图1.化合物两种构型的化学结构 

2.计算方法

本研究采用的计算方法简述如下（详见《计算方法》文档）：

A.采用在线工具PIGSPro预测抗体的三维结构，通过分子动力学模拟优化结构；

B.采用在线工具POCASA 1.1预测优化的抗体结构上潜在的结合位点；

C.采用DOCK 6.7将化合物对接到各个预测位点中，根据打分和结合模式，挑选最佳的结合模式进行分析。

3.结果分析

A.同源模建

采用在线工具PIGSPro（http://cassandra.med.uniroma1.it/AbPrediction/web/）对抗体进行同源模建。首先进行序列比对，采用单序列模式，从已知三维结构的数据库中分别针对L链和H链搜索序列相似的蛋白质结构。L链的模板为XXX，H链的模板为XXX和XXX。序列比对如下（保密需要，部分数据不公开）：

Light Chain Target - Template alignment：

Heavy Chain Target - Template alignment：

初步建立的三维结构如下图（图2）所示。抗体由L链和H链构成，两链的接触面中部形成环桶状结构，与文献结果一致。与模板蛋白不同的抗体氨基酸区域（L链：NX-X、DX-SX、GX-FX，H链：GX-YX、SX-YX、GX-DX）集中在该环桶状结构的一端及周围，提示该区域为抗体识别抗原和半抗原的位点。

对结构进行质量评估，包括：Ramachandran图和Verify3D。Ramachandran图结果（图3）表明，170个氨基酸（89.0%）落入最大偏好的区域（most favoured regions），17个氨基酸（8.9%）落入额外允许区域（additional allowed regions），3个氨基酸（1.6%）落在宽松允许区域（generously  allowed regions），只有1个氨基酸ThrXL（0.5%）落在了非允许区域（disallowed region）。Verify3D检验要求至少80%的氨基酸的平均3D-1D打分不小于0.2，分析结果表明，L链全部氨基酸的打分均大于0.2，而H链99.12%的氨基酸残基打分大于0.2。因此，采用同源模建方法构建的抗体结构较为合理。

图2.抗体的同源模建三维结构： 绿色为H链，蓝色为L链，洋红色为与模板蛋白不同的抗体氨基酸区域。  图3.抗体结构优化前后的Ramachandran图 

B.动力学优化

采用同源模建方法构建的抗体三维结构仍然存在一些质量问题，比如L链的ThrX落在非允许区域内，H链的ArgX、LysX和GluX落在宽松允许区域。其中，LysX和GluX位于环桶状区域内，GluX可能是抗体的识别位点之一。因此，我们采用分子动力学模拟方法对结构进行优化。

我们采用Gromacs 2016在水溶液中进行了10 ns的动力学模拟。骨架C原子的RMSD曲线表明（图4），体系已经达到平衡状态。基于RMSD的聚类分析表明，蛋白质各帧构象非常相似（RMSD < 0.15nm），全部帧落入同一簇中，因此，采用最后一帧的构象作为抗体的最终优化结构。

Ramchandran质量评估结果表明（图3），原出于非允许区域和宽松允许区域的氨基酸残基均得到优化。Verify3D结果也表明，L链全部氨基酸残基合格，H链99.12%的氨基酸残基合格。因此，该结构已得到优化，可用作分子对接。

图4.分子动力学模拟RMSD图 

C.结合位点预测

在优化的抗体结构基础上，采用POCASA（http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）在线工具预测结合位点。结果表明（图 5），抗体存在4个可能的结合位点（Site 1-4），其中Site 1-3位于环桶状结构区域开口同一侧，Site 4位于另一侧。Site 4体积最小，不足以容纳小分子，我们认为该区域为伪位点。因此，我们选取Site1-3作为分子对接的3个潜在的结合位点。

图5.抗体的预测结合位点 

D.结合模式分析

采用DOCK6.7软件针对3个潜在位点进行了分子对接计算。结果（表1）与预期一致，化合物的两个构型在Site1的结合力均显著高于在其他位点上的结合力。据此，我们认为化合物的结合位点是Site1。经分析，我们以两构型的第一个对接构象（Pose 1）为例进行结合模式分析。

表1.各结合位点各化合物的分子对接打分情况（单位：kcal/mol）  

化合物的两个构型在Site 1中的结合模式具有一定的相似性——两者的结合取向大体一致，R3基团部分与PheXL、TyrXH等氨基酸形成疏水作用，R1-3,5-二氯苯环部分朝向LeuX（图6）。由于构型的原因，两者的结合模式又表现出各自的特征。

化合物R构型的R1-3,5-二氯苯环上的一个氯原子与SerXH和LeuXH形成疏水作用，苯环部分与ArgXH和TyrXL形成疏水作用。同时，苯环部分还与TyrXL的苯环结构形成疏水作用和T型π-π堆积作用，芳环中心距离为4.9Å。疏水作用和π-π堆积作用为化合物R构型的结合提供了强大的范德华力（Grid_vdw = -38.91 kcal/mol）。苯环部分还与碱性氨基酸ArgXH形成π-阳离子相互作用，电荷中心与芳环中心距离为3.7Å。连接R3基团和R1-氨基-3,5-二氯苯环上的中间连接部分通过基团R2和R3与AspXH形成2个氢键作用，键长分别为2.7Å和3.0Å。π-阳离子作用和氢键等极性作用为化合物的结合提供了可观的静电力贡献（Grid_es = -5.82 kcal/mol）。

化合物S构型由于不同的构型而使R1-3,5-二氯苯环沿着化合物轴向伸展。与R构型类似地，其中一个氯原子与TyrXH和LeuXH形成疏水作用，另一个氯原子则与AspXH形成疏水作用，与MetXH形成长度为3.2 Å的卤键。同时，苯环部分与TyrXL形成T型的π-π堆积作用，芳环中心距离为5.1Å。由于距离较远，苯环间未能形成疏水作用。由于氯原子的参与，疏水作用相对R构型更强，Grid_vdw达到-41.65 kcal/mol。同样地，苯环部分与ArgXH形成π-阳离子相互作用，芳环中心距离电荷中心4.1Å。在S构型中，中间连接部分的基团R2和R3转向另一侧，远离AspXH，因而失去了在R构型中可见到的氢键作用。因此，S构型的静电力作用下降（Grid_es = -1.61 kcal/mol）。

综上所述，抗体通过氢键、π-π堆积、π-阳离子作用、卤键及疏水作用等相互作用特异性地识别化合物，而针对不同构型的化合物，识别模式有一些区别。

图6.化合物R构型（A）和S构型（B）在抗体Site 1的结合模式：抗体以泥绿色（smudge）卡通（cartoon）形式表示，关键残基以麦色（wheat）棍状（stick）表示，化合物则以绿色（green）棍状表示；蓝色虚线表示氢键，绿色虚线表示卤键，橙色虚线表示π-π堆积，黄色虚线表示π-阳离子相互作用，灰色虚线表示疏水作用。

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