【Bionano】理解Bionano及其原始BNX数据
前面写过如何用HiC数据进行挂载的，今天开始系统学习一下bionano（也可以做挂载这一步），因为最近接触的一个项目里面除了HiC数据，还有Bionano数据，网上关于HiC的帖子和笔记很多，关于bionano的还比较少。我也主要学习这个博主的（https://www.jianshu.com/p/c4735c266fc7）。
Bionano技术简单来说，就是给分子加上荧光标记，然后拍照，所以最原始的下机数据就是TIFF格式，但是我们拿到的一般都是经AutoDetect/IrysView 转换过的BNX格式。
百度上解释：Bionano光学图谱展现了天然DNA分子的真实景观。利用SP DNA分离试剂盒获得超长DNA分子，用直接标记染色法(DLS)进行无损荧光标记，通过纳米微流控芯片将每一条DNA分子线性化展开，并进行高分辨率荧光成像，为基因组学下游应用提供原始DNA景观。这一真实的基因组物理图谱，为基因组组装提供了染色体尺度的框架，并能高效检测到大片段纯合子和杂合子结构变异。
The Bionano Genomics BNX file is a raw dataview of molecule and label information and quality scores per channelidentified during a run. BNX v1.3 supports one or two label channels (colors).
简单的说，BNX记录的是在泳道中每个单分子原始信息，包括分子中的标记信息和每个泳道的质量得分。
和生信领域常见的SAM/VCF格式类似，BNX也分为两个部分，元信息行和数据行。
元信息行中比较容易理解的行是下面几个，基本不需要解释。下面是我数据的格式：
# BNX File Version: 1.3 //版本信息
# Label Channels: 1 //1表示单酶 2 表示双酶
# Nickase Recognition Site 1: cttaag;bngflgr001 //酶切识别位点
# Bases per Pixel: 500 //分辨率
"rh"其实是RequiredHeaders的缩写，记录的是"Run Data"中一定要有的列，其实这一列类似于vcf的title列了。其中：
SNRFilterType: 信噪比的过滤类型，如果有这一列，就表示你后续就不用做SNR Filter
MinMoleculeLength: 所允许的最短的分子长度
MinLabelSNR：所允许的最低标记的SNR
而"Run Data"每一行表示的是不同的队列(corhart)或者称之为泳道。
目前的主流Bionano设备已经是Sapjyr，BNX文件产生于Saphyr，经由Bionano Access 下载到本地。
===数据过滤和评估====
软件安装：从https://bionanogenomics.com/support/software-downloads/下载Solve软件。（这个软件包有点大，差不多10G了）
tar -zxvf Solve3.3_10252018.tar.gz
解压缩后里有如下几个文件夹
cohortQC: 主要是MQR运行脚本
HybridScaffold: 单酶系统和双酶系统混合组装工具脚本
Pipeline：从头组装的脚本
RefAligner：用于序列联配和组装
RefGenome：hg19和hg38的cmp文件
SVMerge: 用于合并单酶系统得到SV结果
UTIL: 运行从头组装的一些实用shell脚本，可以根据需要进行修改
VariantAnnotation: 对找到的SV进行注释
VCFConverter: 将SMAP和SVMerge的结果输出成VCF格式
数据过滤：
grep "# Run Data" all.bnx | wc -l
我们发现发现数据集来自于1120个通道。
Label SNR 过滤: 过滤信噪比较低的分子，信噪比低意味着质量差。有如下几个情况，不需要做LabelSNR 过滤,或在你BNX文件的"#rh"部分有"SNRFilterType"定义，就不需要过滤
我们的数据不需要过滤。
Bionanao Access 1.2 以后新的图像检测算法得到的BNX文件不需要SNR过滤.
对于AutoDetect或Irysview处理过的数据，默认会进行label SNR过滤，处理之后就是Molecules.bnx。
perl /gpfs03/home/jingjing/software/Solve_3.3.1/cohortQC/10252018/filter_SNR_dynamic.pl-i RawMolecules.bnx -o Molecules_filter.bnx -P diag_hist.pdf
分子长度过滤: 过滤短与某个阈值的分子，公司一般会只保留100kb或120Kb以上的分子(取决于数据量，数据越多，阈值越高)
/gpfs03/home/jingjing/software/Solve_3.3.1/RefAligner/7915.7989rel/./RefAligner -i all.bnx -minlen 120 -merge -o output -bnx
运行log中显示：
Final maps=3430511, sites=149096069, length= 745879562.262kb (avg= 217.425 kb, label density= 19.989 /100kb)
表明过滤后，还有343万条分子，涉及到14909万标记，总测序量为745G，标记密度是19.989/100kb，平均分子长度大于217Kb.. 测序深度等于总测序量除以基因组大小，这是我们基因组大小4G计算，那么深度就是180X。
注意：过滤后平均分子长度应大于200Kb。标记密度不能过高，过高会因分辨率不够而无法区分，过低则无法用于比对。一般DLS在10~25 ， NRLS在8~15。
组装评估: 在正式组装之前，我们还需要判断下当前数据是否满足组装要求。为了获取所需的评估参数，得将过滤后的BNX文件和基因组模拟模切得到的CMAP进行比对。
第一步: 对基因组序列模拟酶切，得到CMAP文件。
perl /gpfs03/home/jingjing/software/Solve_3.3.1/Pipeline/10252018/fa2cmap_multi_color.pl -i /gpfs03/bioinfo/20210607_K326/ -e cttaag 1
第二步: 用align_bnx_to_cmap.py进行比对。bionano光学图谱比对的基本原理是基于标记的相对位置。
python /gpfs03/home/jingjing/software/Solve_3.3.1/Pipeline/10252018/align_bnx_to_cmap.py --prefix tobacco --mol output.bnx --ref assembly_k326.HiC_scaffold_CTTAAG_0kb_0labels.cmap --ra /gpfs03/home/jingjing/software/Solve_3.3.1/RefAligner/7915.7989rel --nthreads 40 --output prealign --snrFilter 2 --color 1
其中：“contigs/alignmolvref/alignmol_log_simple.txt”里的“Fractionof aligned molecules”和"Effective coverage of reference (X)". 我们要判断数据是否符合最低的比对率。比对率和基因组实际情况有关(组装质量，错误率，重复坍缩情况)。对于人类基因可以达到90%以上，对于不怎么完整度的基因组，即便Bionano的质量很高，比对率可能也只有30%~40%(仅统计150 kb 的分子）
可以看出，我们数据的比对率大概在25%左右。
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