外显子测序

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1.相关名词

• 外显子组（exome）是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，在人类基因中大约有180,000外显子，占人类基因组的1%，约30MB，包含了约85%的致病突变。外显子是基因行使其功能最直接的体现。因此，通过高通量测序技术进行外显子组测序，可以直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。

• 外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，然后通过高通量测序，主要识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及调控区域（Untranslated Regionds,UTR）相关遗传突变的技术手段。

• 捕获效率：指比对到目标区域的有效数据量占总的数据量的比例。

• 覆盖度：目标区域被覆盖到的比率，是客户较为关心的指标。

• 有效测序深度：实际测序数据量 * 捕获效率 / 捕获区间

• SNP:Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性，指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。

• Indel：插入和缺失突变。

• CNV：Copy number variations，基因拷贝数变异。

• SV：structure variations，结构变异。

• LOH：loss of heterozygosity，杂合性丢失。

• Somtic mutation：体细胞突变，广泛采用外显子测序技术检测。

• Germline mutation：即遗传自父/母的突变，胚胎时既已形成，多采用全基因组测序检测。

2.研究对象

• 正常人群研究

• 遗传病和罕见病研究

• 复杂疾病（癌症）研究

3.常见样本

3.1样本组成

• 配对样本(matched pairs)
• 群体病例和群体正常样本(Cases and unmatched controls)
• 家系样本(Family trials)
• 原位癌和转移癌样本(In situ carcinoma and metastatic carcinoma)

3.2取样方式

• 癌症组织和癌旁未受影响的正常组织
• 疾病组织和自身血液样本
• 家系样本可以通过抽血研究孟德尔遗传病

• 取样时间：不能经过化疗放疗和药物治疗，即化疗放疗之前。
• 保存方式：液氮冻存或-80 冻存 干冰运输
• 取样大小：组织大约黄豆粒大小，血液2ml以上
• 备注：石蜡切片样本也可以做，先看预实验的结果

4.测序平台

4.1HisSeq 4000

HiSeq 4000利用Illuina测序系统所使用的边合成便测序成熟技术，最大限度降低了掺入偏好性，并大大降低了原始错误率，每次运行（3.5天）通量高达1.5Tb，可以在更短的时间内以更多的测序深度完成更多样品的检测。

HiSeq 4000

4.2HisSeq X 10

HiSeqX Ten由10台HiSeqX测序仪组成，是定位为“测序工厂”模式的系统，适合运行于大型基因组测序中心，为各类生命科学和生物医学研究提供海量、高效率的测序服务，每次运行仅需要3天时间，即可产出高达1.8Tb的数据。

HisSeq X 10

4.3测序过程中产生的冗余数据原因

（1）在杂交捕获过程中，与目标序列同源的序列也会被捕获到，且捕获到的目标序列会携带一部分突出目标范围之外的序列，这一部分将不计入测序的有效测序深度。
（2）在建库过程中PCR扩增而造成的Duplication，通常选择留下数据质量较高的子分子，最后是测序平台在读取序列时会因为重复读取而产生冗余序列。

4.4 推荐测序方案

• 配对样本：推荐5对以上，测序深度推荐大于50X。
• 大规模病例和对照样本：>500，全基因组重测推荐4_{6X，全外显子组重测序推荐10}30X。
• 家系样本：须有正常家系对照，推荐测序深度50X以上。
• 测序平台推荐HiSeq X ten

外显子测序主要适用于肿瘤易感性、致病机理、癌症异质性、转移和复发以及药物疗效研究。其中癌症异质性需要高深度测序，建议200X以上有效深度，FFPE样品建议200-300X对应的数据量，需要尽量全面、准确地检测肿瘤组织发生的所有突变信息，所以测序深度需要尽可能高，以检测低丰度突变位点。ctDNA建议500X及以上有效测序深度，用于检测Somatic 突变以及频率来判断ctDNA的存在和水平，从而反应肿瘤负荷等信息。##5.捕获芯片
目前主流的捕获试剂盒有Agilen 公司的SureSelect，Illuina公司的Nextera和Roche的Nimble Gen为主，另外还有Life的Ion AmpliSeq TM Exome Kit，以下是捕获试剂盒的各项指标的介绍：

5.1 Agilent t SureSelect Human All Exon

• 产品线丰富，可用于在单个试管中捕获从小于200 Kb 到大于 50 Mb 大小范围内的靶向序列

• 可利用安捷伦的eArray 在线设计工具，定制基于原人全外显子试剂盒的SureSelect 靶向序列富集产品

• 除了可以支持Illumina系统的单末端和双末端测序以及indexing方案外，还支持SOLiD系统的片段文库测序、双末端测序和barcoding方案

5.2 NimbleGen SeqCap EZ Library

• 数据可靠：用内部质控探针来指示整个系统的运行情况，基于已知的独特基因组位点，计算富集倍数。

• 高均一性、高覆盖率：对指定区域采用advanced repeat masking方法设计探针，保证了很好均一性（uniformity）和覆盖率（coverage），可以有效捕捉到每个靶向序列，帮助用户对目标区域进行精确细致的分析，从而有效检测SNP突变。

• 高度灵活性：捕获序列可以是连续的基因组序列，或者是成千上万的独立位点或外显子序列；并且可对接多家二代测序平台。

5.3 Illumina’s TruSeq Exome Enrichment

• 简单、可扩展的流程：预混合的试剂加上最多能处理96个样品的平板，可高度自动化，以便达到更高的通量。

• 高效率和全面的覆盖度：利用95 bp的寡核苷酸来靶定大约62 Mb的外显子组序列，覆盖最新RefSeq的91%（2010年9月hg19 Build）以及2010年9月发布的CCDS（合作保守编码序列）的95%。

6.数据分析

具体的分析流程会在后面详细介绍，暂时不赘述。

6.1分析流程

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6.2质控

6.2比对

6.3去重

6.4重校正和重比对

6.5预测SNP和indel

6.6突变分析

体细胞突变与注释 突变率和突变类型的分析 显著基因分析 信号通路分析 拷贝数变异

6.7注释分析

7.外显子测序优劣

7.1外显子测序优势

• 人类85%的疾病位点位于编码区域
• 外显子组可以提供更深的测序深度
• 外显子组花费更低

7.2外显子测序劣势

在WES的数据分析中，因测序量仅为整个基因组的1%~2%，所以对基因组的结构变异是不敏感的；而WES中杂交捕获过程是一个具有偶然性的过程，会造成读取的reads数忽高忽低，因此对CNV也不是很敏感，且外显子测序对小片段的拷贝数的变异本身就不太敏感，但对于大片段拷贝数，如5M以上还是可以进行深度测序。

8.各测序公司服务

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华大疾病信息分析内容

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华大肿瘤信息分析内容

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诺禾疾病基因组学

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诺禾癌症基因组学

实质分析内容都差不多，只要图好看就行。不过可以以此针对性学习。

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