类器官构建过程中的注意事项

类器官（Organoid / Patient Derived Organoid, PDO）是经过体外3D培养，通过细胞自组装形成的微型三维细胞聚集体，它可以在很大程度模拟人体同类组织或器官的遗传特征和表观特征。作为一种新兴的前沿技术，类器官在人体组织器官的发育、稳态、生理和疾病机制、精准医疗、再生医学、药物筛选等领域都有广泛的应用前景。

目前研究人员倾向于使用体外模型进行药物筛选和评估。除了避免动物实验的伦理问题，还可以缩短研究周期并降低成本，构建适当的体外模型能准确地反映体内环境，并在此基础上可以准确反映目的药物的药效学和药代动力学。

但在类器官实际构建过程中，我们或多或少会遇到一些问题，比如新构建的类器官长不起来，如何模拟体内环境，如何避免污染这些都是许多科研人想要解决的问题。

构建成功的类器官三个因素：

1. 组织样本：包括组织活性强度，组织量的大小，保存和运输条件。

2. 培养试剂：包括组织消化酶的选择，类器官培养基。

3. 操作手法：包括原代剪切手法和消化程度的辨别。

这几个因素决定我们是否能培养出类器官，类器官的量是多还是少。

1. 组织样本

由于组织活性不足而导致构建失败占了80%以上，我们在临床取样的时候更倾向于去取癌旁，癌组织边缘，因为这个部位的癌干细胞侵袭性强，活性比较高。往往经过了化疗或者放疗的患者的癌组织中间，纤维化，钙化程度较高，中心坏死细胞比较多，癌干活性低，不适合用于构建类器官。因此建议取未经化疗或者放疗的组织，转移性的癌组织也比较适合。例如要分离肝癌类器官，如果到手的组织是白色豆腐脑状，瘫软，发黑，这种组织不适合，因为由于肝癌增长过快，中心会因为缺血，缺营养导致组织坏死。一个好的肝癌样本，应该是组织边缘完整，没有糜烂的现象，色泽呈浅红或稍稍泛白。我们在镜下也可以将组织剪碎后放到皿中初步观察，假如镜下除了杂质外，都没有几个细胞，或者细胞发黑，碎片多，这种是肯定不适合构建类器官的。一个好的样本在镜下初步观察可以看到许多圆形细胞，在经过消化后，会呈现出多个细胞团。

第二个组织量的大小也有要求，一般手术样本的大小，至少有黄豆大小，如果样本很大，建议取肿瘤边缘的组织（非纤维化、非钙化、非坏死的组织），各个方向（上下左右）都建议取一块。如果是穿刺样本，建议至少要2cm以上，手术样本和穿刺样本都需要浸没到组织保存液中进行4℃低温运输。如果是新鲜的胸腹水，需要至少50mL的体积，并低温运输。时间控制在48小时以内，越早做成功率越高。

2. 培养试剂

组织消化液的选择非常关键，如果用胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ，那么消化时间比较长，消化时间越长细胞活性越低。类器官的培养实际上是在培养成体干或者肿瘤干，这些干细胞的培养是要比普通原代提取是要难的，消化效果太强，干细胞活性受损，消化效果太弱，消化时间长对干细胞活性也不好，最好将消化时间控制在15-30分钟，对于比较硬的组织，例如肝胆管癌、食管癌，消化时间需要控制在1个小时以内。

第二个是培养基的选择，培养基的因子很多，如果按某一个文献的配方来做，这个配方可能有所保留，可能也养不好，需要结合多篇文献来摸索，但这个耗费的时间精力是巨大的，目前有商业化的培养基可供科研人选择，这些培养基是为研究某种类器官特定摸索研究得到的，可以节省科研人的时间成本。

3. 操作手法

类器官的原代提取的流程

组织清洗：在收到新鲜组织样本后，需要用原代缓冲液清洗3-5次以去除样本表面血液，在放入4℃预冷的组织保存液中保存运输。（如果样本前期保存不当会导致细胞活性差、污染、正常细胞少等问题，降低构建成功率。）接着将组织转移至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。准备多个60mm培养皿，往培养皿中加入4℃预冷的原代缓冲液备用。将组织放入培养皿中，原代缓冲液清洗3-5次，洗去杂质。

剪切：使用眼科剪或手术刀将组织切割成体积约为1~3mm的组织块（建议放入1.5mL EP管剪碎组织）。对于较硬的组织可以剪得更细一点，更利于消化。组织在剪完以后也是会有细胞团的，不一定非要等到消化后在看，我们剪切好组织后，可以取样在显微镜下初步判断样本的好坏。

消化：接着进行消化，往剪碎后的组织块中加入3mL（约组织体积3-5倍体积）的原代组织消化液（多加一点也没有关系），37℃摇床中震荡消化，消化过程中随时观察组织消化情况。10分钟后取少量消化液在显微镜下观察，当在镜下观察到较多的细胞簇或单个细胞后，加入3倍体积原代缓冲液终止消化，如果没有出现大量的细胞团，则继续消化。一般消化好后可以看到液体变浑浊。

消化的比较好的类器官，细胞团比较多

过滤：终止消化后将所有液体通过100μm孔径的筛网过滤，将细胞滤液置于离心机中以300g离心5分钟，弃去上清，加入原代缓冲液再次重悬，再次300g离心5分钟后弃去上清。如果在这一步没有出现细胞沉淀，可能是由于离心力不够，或者是在过滤的时候细胞团没有吹下来，可以用多一点的缓冲液多次冲洗筛网上的细胞团，还有可能是离心结束后弃上清的时候直接倒掉了，一般建议用枪慢慢地把上清弃去，还有可能是没有消化好。如果细胞沉淀含有红细胞，弃上清后加入1mL红细胞裂解液，裂解1-2分钟后稀释至10mL，再次以300g离心5分钟。红细胞的存在会不利于类器官的观察，当红细胞量少时也可ui不进行裂红。

点胶加液：尽量去除上清，观察收集到的细胞沉淀体积量，添加25倍细胞沉淀体积的基质胶重悬（基质胶提前1天放4度冰箱融化，点胶时再把基质胶拿出来）充分混匀，并置于冷冻管架上保持0-4℃。基质胶对温度比较敏感，从加胶点样的时间需要把控，还有用基质胶重悬细胞团的时候，重悬的时间太久，会吹出很多气泡，而这些气泡会黏附在耗材上，会使类器官丢失。以24孔细胞培养板为例，每孔点25-30 μL组织基质胶混合物进行铺板。放入37℃培养箱中15-30分钟，等待基质胶凝固。每孔加750μL恢复至室温或预热的类器官培养基，置于37℃培养箱中培养。

原代操作过程中，要注意无菌操作，并确保使用的耗材无菌，使用的剪刀镊子需要进行高压灭菌，没有高压灭菌条件也要用酒精灯灼烧，用酒精棉球进行擦拭；运输过程中可以往组织保存液中加入1%PS。如果不幸出现污染，这个孔的类器官是一定要舍弃的。

类器官污染