接种疫苗如何获得持久免疫？单细胞多组学来揭晓
单细胞测序技术使得细胞异质性信息能够被充分挖掘。在单细胞转录组测序技术出现之后，其他单细胞组学技术也陆续出现并和单细胞转录组一起被广泛应用，单细胞多组学也在2019年被评为年度技术。目前，单细胞多组学联合应用似乎已经成了CNS级别单细胞研究的标配。
2021年6月25日，斯坦福大学医学院的研究人员在期刊《Cell》报道了利用单细胞多组学（snRNA-seq、snATAC-seq）研究人类季节性和大流行性流感疫苗免疫的表观基因组和转录图谱。该研究发现接种流感疫苗会导致多个免疫细胞亚群的染色质状态发生整体变化并且可持续长达6个月；这些变化在髓系细胞中最为明显，这表明AP-1转录因子靶向位点向不可及的染色质转变，并减少细胞因子的产生。接种AS03辅助的H5N1大流行前流感疫苗还可增加IRF和STAT位点的染色质可及性，增强对异源病毒感染的抵抗力。这些发现对未来由表观遗传佐剂组成的疫苗的设计有重要意义。
一、TIV疫苗免疫如何在单细胞水平上影响免疫系统的表观基因组？
1、研究方法
对21名健康个体三价灭活季节性流感疫苗（TIV）接种-12、0、1、7、30和180天分离的PBMCs进行EpiTOF分析。同时让10名受试者在-3和1天接受口服抗生素以确定肠道微生物群对表观基因组免疫细胞景观的影响。
图1 TIV对免疫系统表观基因组影响的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
第30天疫苗接种的样本明显分离，表明TIV诱导了表观遗传变化。在第30天的样本中检测到CD34+细胞中几个组蛋白甲基化标记增加，髓样细胞中多个乙酰化标记减少。抗生素状态对组蛋白修饰水平没有可测量的影响。接种疫苗后第30天，经典单核细胞和髓样树突状细胞表现H2BK5ac、H3K9ac、H3K27ac和H4K5ac以及PADI4（催化组蛋白瓜氨酸化）抑制，并且在第30天显示最大的抑制，在第180天基本恢复到初始水平。在使用H3K27ac、H2BK5ac、H4K5ac、H3K9ac和PADI4标记对mDCs和经典单核细胞构建的单细胞组蛋白修饰图谱中，第0天和第1天的细胞聚集在2D空间的一侧，第30天的细胞占据相反的一侧，第180天的细胞没有回到第0天的初始位置，而是呈现中间状态，表明在用TIV免疫后6个月内可以检测到持续的表观遗传变化。
图2 TIV改变免疫细胞的组蛋白修饰（图片引自文献[1]）
二、 髓系细胞中的表观遗传变化具有什么样的后果？
1、研究方法
在接种前后的不同时间点用模拟细菌或病毒病原体相关分子模式的合成Toll样受体（TLR）配体混合物刺激接种个体的PBMCs。
图3 表观遗传变化功能后果的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
在接种疫苗后第1天至第7天细胞因子反应就明显减少，在第30天达到最低点，并在第180天恢复到接近初始水平。显著减少的细胞因子包括TNF-a、IL-1b、IL-1RA、IL-12、IL-10、MCP1、 MCP3、ENA78 （CXCL5）、IP-10 （CXCL10）和GCSF。H3K27ac和PADI4等显著变化的组蛋白乙酰化标记与细胞因子的产生呈正相关，而H3K27me3和H4K20me3等与细胞因子产生呈负相关。用组蛋白乙酰转移酶抑制剂A-485和PADI4抑制剂Cl—脒体外处理证实了上述结果。
图4 TIV诱导的组蛋白修饰变化与细胞因子产生相关（图片引自文献[1]）
三、TIV疫苗免疫如何影响染色质可及性？
1、研究方法
对疫苗接种前后荧光激活细胞分选（FACS）纯化的先天免疫细胞亚群进行了ATAC-seq分析。
图5 TIV对染色质可及性影响的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
CD14+单核细胞和髓样树突状细胞中大多数差异可及区域（DARs）显示染色质可及性降低，表明基因活性降低。CD14+单核细胞中所有DARs与TLR和细胞因子信号和基因组重排显著富集。在单核细胞和髓样树突状细胞中AP-1家族（包括c-Jun和c-Fos） bZIP TFs明显富集，携带这种Motif的单核细胞在接种疫苗后染色质可及性降低，尤其是在非启动子区域。AP-1 TF表达的减少在接种疫苗后第7天首次被检测到，在第28天最明显。多个AP-1家族成员的靶基因的显著富集。组蛋白乙酰化/PADI4降低和AP-1可及性降低之间的因果联系同样被组蛋白乙酰化和PADI活性特异性抑制剂处理证实。
图6 TIV诱导免疫反应基因和AP-1控制区染色质可及性降低（图片引自文献[1]）
四、细胞异质性如何影响细胞的表观基因组及其对疫苗接种的反应？
1、研究方法
分离来自接种个体的PBMCs，富集DC亚群，进行scATAC-seq和scRNA-seq分析。
图7 细胞异质性对疫苗接种反应影响的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
scATAC-seq和scRNA-seq确定了包括经典和非经典单核细胞、骨髓间充质干细胞和血小板衍生细胞等所有主要先天免疫细胞亚群。在接种后第30天经典单核细胞和髓样树突状细胞（cDC1和cDC2）的AP-1可及性大大降低，并且AP-1可及性的降低在接种疫苗后的第1天就开始了，表明TIV诱导的表观基因组重编程是在疫苗应答的急性期印记的。经典单核细胞亚群之间观察到的异质性是由AP-1的差异驱动的。虽然在第0天的主要簇（簇6和8）在AP-1可及性方面较高，但是在第30天主要发现的簇5中的细胞在AP-1中较低。异质性基因组区域与促炎细胞因子和TLR信号传导相关的区域富集，包括与AP-1成员FOS和JUN、多种MAP激酶和NFKB相关的区域。与表观基因组相比，转录水平上的细胞异质性并不明显。
图8 单核细胞群内的异质性驱动TIV诱导的表观基因组变化（图片引自文献[1]）
五、H5N1+AS03疫苗为什么比H5N1更有效？
1、研究方法
对在第0天和第21天接受H5N1禽流感疫苗和H5N1禽流感疫苗及佐剂AS03注射的队列进行EpiTOF、snRNA-seq、snATAC-seq分析。
图9 H5N1+AS03和H5N1疫苗接种比较的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
接种H5N1+AS03疫苗诱导经典单核细胞中H3K27ac、H4K5ac、H3K9ac和PADI4显著减少，大多数先天细胞因子和趋化因子的产生显著减少，而仅接种H5N1疫苗并没有引起这些变化。H5N1+AS03的AP-1可及性显著降低，但H5N1不是。与TIV相似，主要DARs富含TLR-和细胞因子信号通路以及先天免疫活性。此外，观察到多个AP-1家族成员的表达减少，包括接种TIV疫苗后观察到的c-Fos和c-Jun。
图10 H5N1+AS03诱导类似于TIV的抑制性表观基因组状态（图片引自文献[1]）
在接种了H5N1+AS03疫苗的受试者的先天免疫细胞群中干扰素应答因子（IRF）和STAT家族的几个TFs在第42天染色质可及性增加，只接种H5N1疫苗无此变化。而且在第21天第一次接种疫苗（加强前）后，这些与IRF相关的变化已经存在。同样，在接种H5N1+AS03疫苗后，多个先天免疫细胞亚群中IRF1和STAT1的表达显著增加，但只接种H5N1疫苗时没有。含有IRF1结合Motif的峰的染色质可及性存在显著变化。在可及性增加的基因中鉴定到许多干扰素（IFN）和抗病毒相关基因。这些结果表明只有接种H5N1+AS03疫苗，而不是单独接种H5N1或TIV疫苗，才能全面提高抗病毒应答位点的可及性。接受H5N1+AS03强化疫苗接种的受试者与对初始疫苗的应答相比，表现出更高水平的抗病毒基因表达，表明IRF位点可及性的增加可能会增强对加强疫苗的反应。
图11 H5N1+AS03诱导增强抗病毒免疫的表观基因组状态（图片引自文献[1]）
六、表观基因组变化是否导致对病毒感染抵抗力增强？
1、研究方法
在第0、21和42天用登革热或寨卡病毒感染PBMCs），培养细胞0、24和48小时，并使用qPCR测定病毒拷贝数。
图12 表观基因组变化对病毒感染抵抗力影响的研究方案（图片引自文献[1]）
2、研究结果
24小时寨卡病毒和登革热病毒拷贝数增加，48小时减少。在接种疫苗后第21天观察到登革热和寨卡病毒的病毒滴度显著降低。虽然登革热和寨卡病毒诱导了干扰素和干扰素的产生，但登革热病毒抑制了IP10的产生。开放染色质相关的抗病毒基因与病毒滴度呈负相关，IRF1是负相关的最高基因之一。第21天IRF1表达增强的受试者在同一时间点显示病毒滴度降低，抗病毒基因ANKRD22也与寨卡病毒和登革病毒滴度呈高度负相关。
图13 H1N1+AS03诱导增强对体外感染异源病毒的抗性（图片引自文献[1]）
参考文献：
Wimmers F, Donato M, Kuo A, et al. The single-cell epigenomic and transcriptional landscape of immunity to influenza vaccination.[J] .Cell, 2021.
