racon+pilon进行三代+二代数据纠错

现在基因组组装的流程一般是用nextdenovo直接组装三代数据，但是三代数据组装出来一般都会有一些问题，所以要对初步组装结果进行纠错。具体流程是先使用三代数据纠错，再使用二代数据纠错，顺序不能反。
首先是使用racon进行三代数据纠错：

#!/bin/bash
#preAssemble指代的是nextdenovo装完的contig

preAssemble=$1
reads=$2

# first polish
minimap2 -d ref1.mni ${preAssemble}
minimap2 -x map-ont -t 50 ref1.mni ${reads} > map1.paf
racon -t 30 ${reads} map1.paf ${preAssemble} > racon1.fa

# second polish
minimap2 -d ref2.mni racon1.fa
minimap2 -x map-ont -t 50 ref2.mni ${reads} > map2.paf
racon -t 30 ${reads} map2.paf racon1.fa > racon2.fa

# third polish
minimap2 -d ref3.mni racon2.fa
minimap2 -x map-ont -t 50 ref3.mni ${reads} > map3.paf
racon -t 30 ${reads} map3.paf racon2.fa > racon3.fa

一般纠错3轮就可以了。
然后是用pilon进行二代数据纠错：

#!/bin/bash
#consensusAssemble指代的是上一步的结果文件

reads1=$1
reads2=$2
consensusAssemble=$3

bwa index ${consensusAssemble}
bwa mem -t 50 ${consensusAssemble} ${reads1} ${reads2} | samtools view -Sb > align1.bam
samtools sort -@ 30 -o align1.sorted.bam align1.bam
samtools index -@ 30 align1.sorted.bam
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=align1.sorted.bam OUTPUT=align1.sorted.markup.bam METRICS_FILE=align1.sorted.markup.bam.metrics
samtools view -@ 30 -q 30 -b align1.sorted.markup.bam > align1.sorted.markup.filter.bam
samtools index -@ 30 align1.sorted.markup.filter.bam
java -Xmx512G -jar pilon-1.24.jar --genome ${consensusAssemble} --frags align1.sorted.markup.filter.bam --fix snps,indels --output pilon_polished1

bwa index pilon_polished1.fasta
bwa mem -t 50 pilon_polished1.fasta ${reads1} ${reads2} | samtools view -Sb > align2.bam
samtools sort -@ 30 -o align2.sorted.bam align2.bam
samtools index -@ 30 align2.sorted.bam
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES= false MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 INPUT=align2.sorted.bam OUTPUT=align2.sorted.markup.bam METRICS_FILE=align2.sorted.markup.bam.metrics
samtools view -@ 30 -q 30 -b align2.sorted.markup.bam > align2.sorted.markup.filter.bam
samtools index -@ 30 align2.sorted.markup.filter.bam
java -Xmx512G -jar pilon-1.24.jar --genome pilon_polished1.fasta --frags align2.sorted.markup.filter.bam --fix snps,indels --output pilon_polished2

注：在标记二代数据的PCR重复时有人会使用sambamba来标记，但是我这里使用出现问题，因此使用picard来标记重复，小伙伴们使用没问题的话也可以使用sambamba来标记，比picard还要快一些。