ATAC-seq 质控

1. 写在前面

• 1 年前看技能树在简书的文字教程第一次跑 ATAC-seq 分析流程，当时还很懵懂，以为每一步只有一个工具，现在通过技能树刚发在 b 站的视频再次学习 ATAC-seq 分析流程，感觉眼界更开阔了，同时看视频总是能偷学到很多 Jimmy 老师的小技巧，简直血赚。
• 视频链接：https://www.bilibili.com/video/BV1C7411C7ez
• 总的一些标准在：https://www.encodeproject.org/atac-seq/
• 涉及的名词解释：https://www.encodeproject.org/data-standards/terms/

2. replicates

• 2 个及以上生物学重复
• 对于无法做生物学重复的样本至少 2 技术重复

3. 总 reads 数

• 单端 25 百万
• 双端 50 百万
• 去重、去线粒体

4. 比对率

• > 95%，可以低至 80%

5. IDR 计算重复情况

• 全称为 Irreproducible Discovery Rate
• 标准：both rescue and self consistency ratios are less than 2
• 目前没需求，先码一下教程：https://www.jianshu.com/p/d8a7056b4294

6. 文库复杂度

• 两个指标
  • Non-Redundant Fraction (NRF) > 0.9
  • PCR Bottlenecking Coefficients 1 and 2, PBC1 > 0.9, PBC2 > 3
• 保姆教程中有：https://doi.org/10.1186/s13072-020-00342-y

7. peak 数量

• The number of peaks within a replicated peak file should be >150,000, though values >100,000 may be acceptable.
• The number of peaks within an IDR peak file should be >70,000, though values >50,000 may be acceptable.

8. nucleosome free region (NFR)

• 目前没有找到教程，待补充

9. 插入片段长度统计（单核小体峰）

• 标准：在 147bp 以上，147*2bp 以下处有峰
• 
• 首先从 bam 文件中抓取插入片段长度信息

cd align/
samtools view WT.last.bam|cut -f9>wt_insert_length.txt

• 然后读入 R 画 hist 图即可

a=read.table("wt_insert_length.txt")
hist(abs(a[,1])))

• 
• 数据质量不佳，200bp 的峰不够显著

10. 计算 FRiP 值

• 全称 Fraction of reads in peaks，即位于 peak 坐标范围内的 reads 占总 reads 的比例
• 标准：FRiP >0.3，可以低至 0.2
• 通过 shell 脚本计算

cd callpeaks/
ls *narrowPeak|while read id;
do
echo $id
bed=../bed/$(basename $id "_peaks.narrowPeak").bed
ls -lh $bed
# a中哪些在b中
ReadsinPeaks=$(bedtools intersect -a $bed -b $id|wc -l|awk '{print $1}')
totalReads=$(wc -l $bed|awk '{print $1}')
echo $ReadsinPeaks $totalReads
echo 'FRiP:' $(bc <<< "scale=2;100*$ReadsinPeaks/$totalReads")'%'
done

• 输出
  • 3391770 25099448 FRiP: 13.51%
  • 7779551 30565190 FRiP: 25.45%
• 视频中 Jimmy 老师认为应该使用去重和去线粒体之前的 bam 转出来的 bed 来计算 FRiP，这个有待进一步考证

11. TSS 富集程度

• 在衡量背景噪音水平上比 FRiP 更关键
• 标准：
• 
• 教程待补充

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