文献学习008--[sc]两篇PBMC单细胞文献阅读
1. A single-cell map for the transcriptomic signatures of peripheral blood mononuclear cells in end stage renal disease
这是今年刚发的一篇文章，影响因子5.991。因为是做PBMC的，来学习一下分析思路和亚群注释的方法。
背景：终末期肾衰存在systemic inflammation和immune deficiency，但背后机制未知。
方法和结果：对10个正常对照HC和10个终末期肾衰ESRD的PBMC样本进行了单细胞测序（是混样送的，实际只送了两个样，真省钱）。HC样本得到12981个细胞，ESRD样本得到9578个细胞。分析结果显示ESRD患者出现了免疫反应、补体级联反应和细胞代谢的上调，细胞周期进程出现了下调。此外，还鉴定了一些驱动ESRD相关转录变化的细胞类型特异性转录因子。
结论：构建了ESRD患者PBMC的high-resolution map（一个样本，九千多个细胞就敢说是high-resolution map？），结果揭示了细胞群特异的通路和转录因子。
这篇文章做的极为简单，Fig 1对所有细胞做了注释，FeaturePlot看了一下marker基因。Fig 2-4分别对单核细胞、NK和B、T细胞做了GSVA通路富集(用的hallmark pathway gene)和SCENIC转录因子预测。所用到的方法之前都写过，见：通路富集和SCENIC。通路富集结果和转录因子预测结果的解读只要能自圆其说即可。
重点来看下是怎么做的PBMC注释吧
注释了9个细胞亚群：
-
粒单系：树突状细胞 (Cluster 13;
CD1C+)和单核细胞 (Clusters 5 和 8;CD68+，Cluster 5: CD14+，高表达S100A8 和 S100A9，是经典单核；Cluster 8 高表达FCGR3A/CD16，是非经典单核) -
巨核系：巨核细胞(
PF4+) -
淋系：
T：(Clusters 0, 1, 3, 4, 9 and 11;CD3D+)
B (Clusters 6 和 12;MS4A1+)
NK (Clusters 2 和 7;CD3D- ,NKG7+)
T细胞还做了亚群细分（四个亚群），但是没有按CD4和CD8来分。别的都是直接用的大群。
TEM/TEMRA 细胞 (effector memory or terminally differentiated effector memory T cells)：高表达细胞毒性分子(GNLY 和FGFBP2) 和其他效应marker (CCL5, NKG7 和 KLRG1)
TN (naive T cells)：高表达CCR7和其他naive基因如LEF1
TCM (central memory T cells)：和TN一样高表达IL7R, LEF1 和 CD27，但是和TN相比，低表达CCR7。高表达在TN中不表达的CCR6。
STMN1+T：高表达细胞周期相关基因STMN1，后续分析排除了这一群细胞。
附更全的T细胞marker参考表
2. Single-cell RNA sequencing reveals the sustained immune cell dysfunction in the pathogenesis of sepsis secondary to bacterial pneumonia
第二篇也是今年的文章，5.731分，做的继发于细菌性肺炎的败血症患者外周血PBMC的单细胞测序。
Fig 1. 常规的图谱展示
A：送样流程。病例样本来自两个患者，患者1 取了stable和recovery期两个样本（Sta-1和Rec-1）。患者2取了stable，acute和recovery三个样本（Sta-2, Acu-2和Rec-2）。5个正常对照样本中HC-1是作者自己送的，HC2-5来自于数据库（是个省钱的办法）。一共测得了52412个细胞。
B和C：umap图分别以细胞群和样本来源着色。B图的细胞注释直接分了三个大群T/NK细胞 (CD3D+ IL32+ NKG7+)，Myeloid细胞(CD14+ FCGR3A+ S100A9+)和B细胞(CD79B+ CD79A+ IGHM+)。❗️这样将NK和T放在一起注释是可以理解的，因为按道理来说NK和T的区别在于T细胞是CD3(CD3D, CD3E等)阳性的，而NK细胞是CD3阴性的，但事实上很多细胞都是NKG7(NK marker)和CD3同时高表达，在E图中也可以看出来。
D：三个大群的通路富集。NK/T细胞主要富集到淋巴细胞活化和适应性免疫反应通路；髓系细胞主要富集到髓系白细胞活化、细胞因子介导的信号通路和对细菌的反应通路；B细胞主要富集到B细胞活化和增殖通路。
E：marker基因展示
F：HC和病例组三个时期细胞群比例展示。NK/T细胞比例持续下降，髓系细胞比例持续上升。提示免疫细胞比例失调在恢复期患者也持续存在。
Fig 2. 细菌性肺炎继发败血症的病理生理过程中干扰素反应和TNFA信号通路上调
因为测了时间点，所以这个fig主要是对不同时间点进行了分析（不管什么细胞，相当于bulk RNAseq）。
A, B和C：急性期、稳定期和恢复期分别和HC相比的差异基因的通路富集。差异基因是用Seurat用的FindMarker()做的，差异基因筛选标准：Adjusted p < 0.05 & |log2FC| > 0.25。随后用fgsea(nperm = 1, minSize = 1, maxSize = 500)做的GSEA通路富集（significant hallmark gene sets）。P < 0.05的通路为显著富集。结果提示和HC相比，病程三个时间点都出现了IFN-r反应的上调。此外急性期和恢复期还出现了NFkB介导的TNFa通路的上调。
D图：在ABC图的基础上查看了IFN-r反应和NFkB介导的TNFa信号通路基因在四个时间点的表达，确实出现了上调。（这里NFkB介导的TNFa通路在三个时期都出现了上调）
E和F：为了探究这两个在病程中持续存在的通路活化是哪种细胞介导的，做了三种免疫细胞群的GSEA通路富集。发现NK/T细胞在病程中所有阶段都出现了IFN-r反应上调，而髓系细胞在急性和恢复期出现了NFkB介导的TNFa信号通路反应上调（和图ABC对应）
G图：查看了疾病过程中基因表达的动态转录变化，发现了8个不同的时间依赖性表达模式，并评估了每个模式的功能。这部分是用TCseq做的。用法之前写过，见：TCseq：基因表达趋势分析。
Fig 3. 细菌性肺炎继发败血症患者的T细胞和NK细胞存在持续的耗竭和凋亡特征
A图：对NK/T细胞进行了亚群细分，得到了10个亚群。
NK(FGFBP2+ NKG7+)
NKT(CD3D+ NCR3+)
Pro-T(MKI67+ STMN1+)
CD4T(CD3D+ CD4+): CD4 Tn(CD4+ CCR7+), CD4 Tpm(LTB+ IL7R+), CD4+CD28+T(CD4+ CD28+), Treg(IL2RA+ FOXP3+)
CD8T(CD3D+ CD8A+ CD8B+): CD8Tn(CD8A+ CCR7+), CD8Te(CCL5+ GZMB+), CD8Tem(GZMA+ GZMK+).
B图：10个亚群的marker基因小提琴图展示
C图：10个亚群的功能富集
D图：既往文献报道sepsis患者的免疫抑制状态主要与淋巴细胞尤其是T细胞的耗竭有关。所以D图查看了T细胞耗竭(PRDM1和 LAG3)、凋亡(TNFSF10, TNFRSF1B, BCL2L11 和CASP3)和激活(CD69)相关基因在三种细胞群中表达的点图。结果显示患者T细胞激活增强，除了CD4+CD28+T细胞以外，其他细胞耗竭和凋亡marker表达也增加。恢复期各种细胞也高表达耗竭和凋亡的marker，说明虽然症状恢复了，免疫细胞的紊乱并没有恢复。（⚠️可以借鉴）
⚠️这个点图的画法可以通过将细胞类型和病程信息贴在一起存在一个新的metadata，再绘制点图即可（堆叠点图）。
E图：不同病程时间点NK/T细胞亚群的比例变化。CD4+ Tn 和CD8+ Tn减少，提示免疫抑制。CD8+ Te和CD8+ Tem增多，提示淋巴细胞活性增强。CD8+ Te和CD8+Tem在急性期增加，稳定期下降，恢复期再次增加。NK细胞在HC和急性期比例差不多，稳定期和恢复期持续增加。
F图：为了进一步探究NK细胞功能，提取了NK细胞，调整resolution进行了再聚类。得到了两个NK细胞群。
G图：两个NK细胞群的功能富集
H图：两个NK细胞群比例变化
Fig 4. 髓系细胞的紊乱主要存在于恢复期
A图：对髓系细胞群进行了细分，得到8个亚群。
巨核细胞 (MK, PF4+ PPBP+)
树突状细胞(DC, JCHAIN+ SEC11C+)
单核细胞(CD14+ /FCGR3A+)：CD14+ Mono1(CD14+ CPVL+), CD14+ Mono2 (S100A8+ VCAN+), CD16+ Mono (FCGR3A+ MS4A7+), HLA-DR+ Mono(HLA-DR+ CD74+), CD24+ Mono(CD24+ CAMP+) 和LDHB+ Mono(LDHB+ STMN1+) 。
单核一般是按CD14和CD16来划分的，后面几个群是作者自己定义的。这些边角小群定义起来很麻烦，也有可能是双细胞。总而言之，单细胞亚群定义没有统一规则，言之有理即可。
B图：8个亚群的marker基因小提琴图展示
C图：8个亚群的功能富集
D图：8个亚群的比例变化。CD24+Mono只在恢复期出现，作者认为是一种新的细胞群
E图：分析了一下和HC相比，恢复期髓系细胞的通路富集，结果提示激活的免疫反应在已经恢复患者的髓系细胞中也存在。
Fig 5.细菌性肺炎继发败血症患者外周血浆细胞出现扩增
A图：对B细胞进行了细分，得到3个亚群。
Bn (TCL1A, IGHD 和 IL4R)
Bm (AIM2, TNFRSF13B 和 CD27)
浆细胞 (MZB1, IGHG3 和 JCHAIN)
这部分B细胞的注释还结合了功能富集的结果
B图：3个亚群的marker基因小提琴图展示
C图：3个亚群的功能富集（结合功能富集结果帮助细胞亚群注释）
D图：3个亚群的比例变化。浆细胞在急性期出现，稳定期进一步增加，恢复期减少。
因此进一步想要去探究浆细胞在急性期和稳定期扩增的机制
由于在前面NK细胞功能富集Fig3C中，富集通路结果显示NK细胞与B细胞增殖，白细胞活化和正向调控凋亡反应相关，所以想要进一步去探究NK细胞和浆细胞扩增的关系。（这个逻辑有点牵强）
E图：HLA-DRA的表达和病程中浆细胞扩增的动态变化相平行（？？牵强）
F图：做了个细胞互作，目的在于说明NK细胞和B细胞的互作对浆细胞的扩增很重要。（牵强）
Fig 6. 单核细胞可能通过IL1B信号通路来促进T细胞的扩增和耗竭
细菌性肺炎继发败血症患者的外周血T细胞呈现免疫活化和抑制的状态。既往文献报道各种单核细胞亚群可能参与了T细胞的活化和凋亡，因此这部分使用NitchNetR分析了单核细胞和T细胞之间的互作。
研究活化：
挑选的sender细胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono, CD24+ Mono, HLA-DR+ Mono 和 LDHB+ Mono(Fig4C显示这些细胞与T细胞活化高度相关)
挑选的receiver细胞：CD8+ Te (A图) 和 CD8+ Tem (B图) （这两个细胞群在病程中比例持续增加）
A, B图：结果显示两种活化相关的互作在恢复期比较集中，急性期则比较稀疏（急性期的图在supplement）
C图：top predicted ligand中，IL1B是所有挑选的sender单核细胞都表达的，对两种receiver T细胞都起到调控作用。100A9, JUN 和 S100A8是IL1B对这两种receiver T进行调控的主要靶点。SPl1, RELA, FOS, EP300, STAT3, IRAK1 和 MC等分子是IL1B对其靶基因进行调控的transcriptional regulators。
研究抑制：
挑选的sender细胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono （Fig4C显示这两个细胞群功能与细胞死亡调控、凋亡、负性调节细胞增殖及负性调节免疫反应相关）
挑选的receiver细胞：CD4+ Tn (D图) 和CD8+ Tn (E图) （在病程中持续下降）
D, E图：结果显示这些sender细胞对CD4+ Tn的调控在急性期比较集中，而和CD8+ Tn的互作在各个时期均有发生。
F图：top predicted ligand中，IL1B是所有挑选的sender单核细胞都表达的，对两种receiver T细胞都起到调控作用。并展示了其靶基因和中间regulator。
因此IL1B可以通过在不同时期作用于不同的靶基因参与到T细胞增殖和耗竭的调控
Fig 7. 细菌性肺炎继发败血症患者和流感性肺炎、SARS-CoV2肺炎继发的败血症存在不同的免疫反应
近期有研究显示病毒和SARS-CoV2引起的败血症在器官功能失调、预后、T细胞数目和亚型比例上均有区别，但是它们在免疫反应上的区别并不明确。
因此作者从数据库中下载了一组新冠引起的败血症性休克数据、一组新冠引起的多器官衰竭数据、一组继发于流感性肺炎的败血症数据、一组细菌性肺炎继发的败血症数据和作者自己的细菌性肺炎继发的败血症数据，五组数据进行了综合分析。
A图：一些干扰素相关基因在五组数据中的表达
B图：五组数据细胞构成差异
C图：五组数据细胞比例变化
D图：SARS和病毒性肺炎败血症相比IFNr通路富集情况
E图：五组数据中T细胞亚群凋亡和耗竭相关基因的表达
这篇文章已经做的比较全面了，思路还算清晰，分析数据量也很大，只发了5分大概是因为有人发的更早。
此外这片文献的method里提到了用于Supervised cell type annotation的SciBet包，之前没有用过，查了一下是张泽民老师开发的，值得学习。
