磁珠纯化的原理（NGS测序文库构建）

背景： 纳米磁珠的广泛应用

现在纳米级别的磁珠发展已经各式各样了，表面性质各不相同，分离原理也不尽相同。但是，基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质--四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是官能基团修饰的高分子材料所构成，其中官能基团行使与核酸结合的工作，提取、生物素捕获、片段筛选功能的不同，表面官能基团不同。

磁珠结构图

当然不仅磁珠应用在核酸制备上，在化学发光、细胞分选、蛋白纯化等应用磁珠依然是大显身手，是因为不同的官能基团，或者偶联其他，如蛋白抗体等。

1. 磁珠吸附DNA的原理

毋庸置疑，NGS上用的最多还是我们的老熟人--贝克曼的XP磁珠。这种羧化磁珠比羟基磁珠产量更高，非特异性结合更少。XP磁珠采用固相可逆固定化技术（Solid-phase reversible immobilization，SPRI）：
（1）反应体系中，较高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性破坏，构象也随之改变，带负电荷的磷酸基团大量暴漏在外面；
（2）带电荷的磷酸基团通过Na+与羧基形成“离子桥”，使得DNA被特异吸附到带羧基的磁珠表面。（该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收）

磁珠吸附的原理

2. 纯化磁珠进行 “片段分选” 的原理

磁珠双选很大程度依赖于PEG：PEG作为一种分子拥挤试剂，达到一定的浓度时，夺取了一定的水，溶液环境变化，会使较大DNA的结构变紧凑，发生坍塌性的转变而凝聚。不同长度的DNA构象稳定性不同，在遵循热力学规律的情况，这与溶液环境与分子拥挤试剂的浓度有很大的关系。即在特定的溶液中，当PEG浓度达到某一临界值时，就会发现一定大小以上的DNA分子构象非连续的发生凝聚。

• DNA越长：表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收（需要加入的磁珠体积更小）。

• DNA越短：就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而回收回来（需要加入的磁珠体积更大）。

其实磁珠只是能吸附大于某个长度的DNA，如下图所示，不同倍数磁珠吸附DNA的跑胶图：

磁珠吸附的DNA胶图

应用举例：如果要筛选特定大小范围的DNA，需要做两步磁珠纯化：
（1）先用高浓度的磁珠筛选掉过大的片段：0.5X纯化磁珠+丢弃磁珠吸附DNA
（2）然后用低浓度的磁珠筛选掉过小的片段：0.15X纯化磁珠+保留磁珠吸附DNA
剩下就是想要的大小范围的DNA。

3. 使用时的 “注意事项”

此外，体系中的PEG还可以增加溶液的粘稠度，让磁珠保持悬浮不容易沉聚，在DNA binding过程中更充分与DNA接触，同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。

但是PEG的DNA沉聚效果容易受到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用，其储存buffer里也会加一些低浓度的pH稳定剂，如Tris-HCl等。

Postscript:
（1）酒精清洗磁珠：DNA吸附上磁珠之后，用75—85%的酒精去清洗体系中残留的盐。（酒精浓度高可以降低DNA的溶解；酒精浓度低可以将盐离子清洗更干净）
（2）磁珠晾干：酒精清理后，先需要晾干磁珠上残留的酒精，以防影响下游实验。
（3）TE buffer溶解:晾干后加入水或者TE buffer，这时体系中已经没有钠离子和PEG，无法形成电桥结构，带负电的DNA和磁珠之间相排斥，水重新包裹DNA形成水化层，使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中。
注意：晾干时磁珠表面无光泽即可，过度干燥，体系失水过多，会导致磁珠DNA进一步聚集，最终DNA很难回溶到水中，影响回收率。