『简述』以大豆疫霉XEG1为核心，简述病原菌与寄主之间的协同进化

『文字稿有诸多错误和不足之处，斟酌阅读』

1. 大家好，今天主要围绕大豆疫霉核心效应子XEG1汇报寄主与病原之间的关系。
2. 为了确保XEG1的故事完整性，我将主要以第二篇文章为主，其余4篇文章作为支撑，从研究背景，研究进展，以及讨论三个方面展开汇报。
3. 植物有免疫系统吗？我们知道，从植物免疫概念的提出，到现在不断完善的植物免疫信号网络，经过三十年的研究，已经明确，除了物理防御外，植物具有两层免疫系统。
4. 三十年来，植物免疫系统不断丰富和完善，近几年的研究也明确了，植物两层免疫系统并非泾渭分明，而是存在相互放大的协同关系。一层是由模式触发的PTI，另一层是由效应子触发的ETI。而今天我们主要聚焦寄主与病原相互作用的第一战场——质外体。在第一战场的研究焦点也无非是模式与受体的识别。
5. 过去三十年来，已有60多个已知配体的受体被鉴定，但是真正以效应子作为pamp分子的受体其实只有少数几个是明确的。下面我们就举例几个模式和受体相互作用的模型作为引入。
6. 通常来说，我们对模式和受体的关系，认知是不足的，或者说是单一的。一般，模式的受体大都是依赖共受体，仅有少数通过单一受体发挥识别作用。这都是作为典型PTI通路的认识。比如右边苹果腐烂病菌valsa mali的一个激发子，通过烟草VIGS，很容易就鉴定到了其受体是的RLP。
7. 第二个例子是几丁质触发的免疫模型，稻瘟病菌会分泌几丁质酶Mochia1降解chitin，阻断chitin触发的免疫；但同时植物质外体存在一种四胎重复蛋白TPR1，可以优先识别这种几丁质酶，以保护chitin不被降解，从而恢复几丁质触发的免疫。因为这里的TPR1未发现有其他生物学功能，因此mochia作为一个负调控植物免疫的因子，其是否有真正的受体，还未知。同时，质外体蛋白OsMBL1也发挥类似的功能。
8. 第三个例子就比较神奇，坏死性病原菌分泌的Tox1被细胞壁相关受体激酶识别后会触发寄主感病性。换句话说就是坏死性病原体（如结节状芽孢杆菌）劫持了通常与生物营养性病原体抗性相关的分子途径。这也说明了坏死性和生物营养性病原菌与寄主植物相互作用的敏感性和抗性的复杂性。
9. 后面，我将围绕这5篇文献讲述XEG1的故事。这些文献都是由南京农业大学王源超老师团队发表的。
10. 首先，通过质谱鉴定到一个大豆疫霉激发子，可以和卵菌INF1一样引起烟草过敏性坏死，而且这种坏死是依赖信号肽的，也就是说XEG可能在质外体作为pamp发挥功能。需要注意的是，这里XEG1有两种亚型。
11. 通过外源施加纯化蛋白，可以触发多种植物的过敏性坏死，同时可以诱发烟草和大豆的抗病性，这也进一步表明XEG1是一个pamp分子。
12. 通常，作为pamp分子，一般是由定位于膜上的模式识别受体识别。为了鉴定XEG1的受体，他们首先验证了XEG1触发的过敏性坏死是否依赖共受体BAK1和SOBIR1,烟草VIGS实验表明：XEG1依赖BAK1而不依赖SOBIR1。然后很快就明确了RXEG1是受体。
13. 然后作者进一步明确了，XEG1对RXEG1的唯一依赖性和RXEG1对XEG1的唯一识别性。双向证明RXEG1就是XEG1的受体。
14. IP实验也证实了前面烟草沉默的结果.
15. 前面是坏死的情况，那从触发免疫反应方面，也明确了XEG1触发的植物免疫是依赖RXEG1的。讲到这里，这个故事主要的内容似乎已经结束了。尽管我没有按照文章发表的时间顺序来说，但是从逻辑上来说鉴定到一个激发子的受体，就到此为止了。但是后面的故事才是寄主和病原协同进化的核心。
16. 实际上，该团队同时还通过IP-MS检测到一种与番茄木葡聚糖特异性内切葡聚糖酶抑制剂蛋白XEGIP具有37%氨基酸同一性的蛋白，将其命名为大豆葡聚糖酶抑制蛋白1（GmGIP1）。pull down和co-IP证实了PsXEG1和GmGIP1之间的相互作用。GmGIP1与天冬氨酸蛋白酶相似，但缺乏关键的催化天冬氨酸残基。当GmGIP1在本氏烟中表达时，未检测到PsXEG1的不稳定性。此外，还证实了XEG1-GmGIP1相互作用是特异性的。
17. 通过蛋白结构同源建模发现GmGIP1与PsXEG1互作中存在5个可能的关键互作区段，将这几个区段的氨基酸替换为丙氨酸后，通过Co-IP发现G5区域在互作中发挥决定作用。
18. 到这里，就有一个问题，既然XEG1可以被RXEG1识别，以触发寄主的PTI反应，这里的GmGIP1与XEG1互作又如何解释？因为GmGIP1是一个葡聚糖酶抑制蛋白。接下来作者研究了GmGIP1是否可以抑制PsXEG1对木葡聚糖的水解。与GmGIP1G5突变体的作用相比，增加纯化的GmGIP1蛋白的量强烈抑制了PsXEG1催化的木葡聚糖体外解聚。PsXEG1活性较低并非由于GmGIP1引起的不稳定性，因为PsXEG1与GmGIP1孵育6小时后依然稳定。这些结果表明，GmGIP1可以作为PsXEG1葡聚糖酶活性的抑制剂。
19. 也正因此，过表达GmGIP1能够介导大豆对大豆疫霉病的抗性，而过表达G5突变体不能增强抗性。同时沉默GmGIP1，显著增加了对大豆疫霉的易感性。
20. 前面是从寄主的角度出发，探索了寄主对XEG1的抑制作用。而从XEG1对大豆疫霉毒力贡献的角度看,两个酶活位点的突变显著减弱了其毒,XEG1对毒力的贡献依赖酶活。
21. 为了确定GmGIP1是否可能抑制其他PsXEG1家族成员，通过Co-IP分析。在测试的10个蛋白中，只有一个叫PsXEG1样蛋白1（PsXLP1）显示出与GmGIP1的相互作用。PsXLP1与PsXEG1具有约67%的氨基酸序列一致性。然而，PsXLP1比PsXEG1短52个残基，因为在C端附近的缺失导致了对酶活性至关重要的一个残基的丢失（E222）。这两种蛋白都靶向质外体。
22. 鉴于他们的序列相似性，评估PsXLP1的水解酶活性。结果表明，PsXLP1缺乏与PsXEG1相当的水解酶活性。
23. 为了鉴定结合GmGIP1所需的PsXLP1的氨基酸，作者通过三维结构建模预测PsXLP1的五个区域（X1至X5）与GmGIP1相互作用，其中一些相互作用残基与PsXEG1共享，一些不同。接下来，测试五个区域中每一个区域的丙氨酸取代突变破坏与GmGIP1相互作用的能力。Co-IP结果表明：X1、X2、X3和X5都是PsXLP1与GmGIP1的完全结合所必需的。
24. 那XEG1和XLP1存在怎样的关系呢？作者发现：PsXLP1的表达模式与PsXEG1的表达模式十分相似。
25. 此此外，PsXEG1和PsXLP1基因在大豆疫霉基因组中相距2370个碱基对，头对头排列，这种头对头排列广泛存在于已测序的几乎所有疫霉。
26. 鉴于XLP1与XEG在某些方面的相似性，毒力测定表明：活性位点突变体及关键互作位点突变体过表达后对大豆表现出更强的毒力。而PsXLP1缺失表现出更弱的毒力。
27. 两个实验的结果是一致的。即，GmGIP1结合PsXLP1所需的残基对于PsXLP1对毒力的贡献至关重要。但PsXLP1的酶活性不参与对毒力的贡献。
28. 由于PsXLP1的GmGIP1结合活性是其毒力贡献所必需的，因此接下来测试了GmGIP-PsXEG1复合物是否可以被PsXLP1破坏。结果表明，PsXLP存在时，PsXEG1-GmGIP1相互作用显著降低，但在PsXLP1X123存在时，其相互作用不变。PsXEG1和GmGIP1相互作用的减少不是由于蛋白质不稳定性，因为PsXLP1蛋白质存在时蛋白质水平没有变化。为了测试PsXLP1如何从GmGIP1复合物中取代PsXEG1，通过ITC测定了GmGIP对PsXEG1和PsXLP 1的体外结合亲和力。解离常数（Kd）表明，PsXLP1与GmGIP1的结合强度是PsXEG1的5倍。这些结果表明，PsXLP1可能保护PsXEG1免受GmGIP1结合。
29. 大豆疫霉PsXLP1的过表达可中和转基因大豆毛状根中GmGIP1的过表达所提供的防御。同时，毛状根中的PsXLP1过表达不会增加对大豆疫霉PsXEG1敲除株的敏感性。
30. XLP1对XEG1的这种保护机制可能被许多疫霉属物种使用。
31. 总的来说大豆疫霉部署了诱饵（PsXLP1）来破坏植物防御。
32. 前面提到，XEG1有两种亚型，XEG1在质外体被降解。其中较小亚型比较大亚型对降解更敏感，表明较大亚型被翻译后修饰。用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）阻断新蛋白质合成后，瞬时表达的PsXEG1迅速降解。较小的亚型对降解特别敏感。此外，天冬氨酸蛋白酶抑制剂PepA显著抑制了PsXEG1的降解。
33. 质外体定位的PsXEG1抑制剂GmGIP1是一种非活性天冬氨酸蛋白酶样蛋白，它与PsXEG1直接相互作用。为了确定GmGIP1的酶活性同源物是否靶向PsXEG1降解，全基因组分析了可能的活性天冬蛋白酶。其中有两个表现出与PsXEG1相似的表达特征，Co-IP结果表明，GmAP5可以与PsXEG1结合，Western也证实了GmAP5对PsXEG1的降解，但其他共表达大豆蛋白没有降解。并且GmAP5在体外只能与PsXEG1的较小亚型互作。此外，消除GmGIP1结合的PsXEG1突变PsXEG1X1，2，3不影响与GmAP5的结合，表明GmAP5和GmGIP1与PsXEG1的结合不同。
34. 进一步用糖苷酶A或者F处理后，较大亚型的PsXEG1显著减少，同时用糖基化抑制剂突尼斯霉素TM处理后，只有较小亚型的PsXEG1表达。这些结果表明，较大亚型是糖基化的PsXEG1,较小亚型是非糖基化的PsXEG1。为了研究糖基化在PsXEG1毒力贡献中的作用，作者分别创制了两个糖基化位点替换的转化子，发现他们的毒力均减弱。这些结果表明，PsXEG1的两个糖基化位点是其对大豆疫霉毒力的完全所必需的。我们先前表明，木糖葡聚糖酶活性是PsXEG1毒力贡献所必需的。我们通过体外木糖葡糖酶活性测定证明，木糖聚糖的酶降解不需要PsXEG1的N-糖基化。
35. PsXEG1分泌不需要N-糖基化。然而，在CHX阻断新蛋白质的合成后，瞬时表达的PsXEG1N174A和N190A-HA迅速降解。在使用与纯化的PsXEG1蛋白混合的大豆质外体液的体外试验中，PsXEG1N174Q和N190Q（由大豆生产）在质外体液体存在下迅速降解，但天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pep A基本上阻止了这种降解。为了确认这些突变蛋白的不稳定性是由于缺乏糖基化所致，还测试了去糖基化的PsXEG1；当与大豆质外体液混合时，其也被降解，但在Pep A的存在下不被降解。总之，这些结果表明天冬氨酸蛋白酶参与了细胞外液对非糖基化PsXEG1的降解。
36. N-糖基化在大豆疫霉感染期间保护PsXEG1不被GmAP5降解。为了评估GmAP5和PsXEG1之间的特异性相互作用是否发生在大豆疫霉感染期间，我们用CRISPR引入的两种携带PsXEG1基因突变的大豆疫霉菌，即T91（PsXAG1N174A和N190A）和T3（PsXEG1Δ），接种过表达或沉默GmAP5的大豆毛状根。当GmAP5在根中过表达时，与WT分离物相比，T91感染显著减少。相反，表达未糖基化的PsXEG1的T91转化体在GmAP5沉默的转基因植物上恢复了毒力。然而，PsXEG1敲除系T3引起了大豆毛状根的类似感染，无论GmAP5是沉默还是过度表达。这些结果表明，GmAP5在大豆防御中的作用取决于PsXEG1的存在，并且N-糖基化在大豆疫霉感染期间保护了PsXEG1免受GmAP5的攻击。
37. 总的来说，大豆疫霉菌进化出一个PsXEG1的同源蛋白PsXLP1，PsXLP1通过C端缺失丧失了酶活性但逃避了GmAP5的识别，以“诱饵模式”与PsXEG1竞争性结合GmGIP1，从而掩护PsXEG1对寄主的进攻。同时，PsXEG1通过糖基化修饰武装自己不被寄主分泌的保外天冬氨酸蛋白酶降解。这些研究全面阐明了寄主与病原菌在质外体间发生的多重复杂免疫模式。
38. 最后的两张片子通过结构的解析明确：RXEG1与XEG1的结合，抑制了XEG1的酶活和毒力水平。
39. 并解释了RXEG1识别XEG1后招募共受体BAK1的结合。
40. 总的来说：大豆疫霉进化出诱饵蛋白，以保护自身核心毒力因子的致病功能，以此抵御寄主的防御输出。然而寄主与病原协同进化过程中的复杂关系还有待更多的研究。
41. 谢谢大家。

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