近日，北京医院泌尿外科刘明主任团队在Clinical and Translational Medicine杂志（IF：11.492）发表一项利用单细胞技术刻画老年前列腺外周区和移行区图谱的研究，揭示了老年前列腺的外周区和移行区之间的异质性，有助于了解前列腺疾病的空间分布特点，并为发现新的治疗靶点奠定基础。

本研究中10x Genomics单细胞转录组测序由百奥益康提供服务。

研究背景

前列腺是一个异质性的腺体，具有表型和功能多样化的细胞亚群。前列腺组织学组成主要包括上皮细胞和纤维肌间质，在解剖学上分为：外周区（PZ）、中央区和移行区(TZ）。先前的研究显示，前列腺疾病的发病率和发展方面存在显著的区域差异，良性前列腺增生（BPH）和前列腺癌（PCa）是老年患者中常见的两种前列腺疾病，BPH主要发生在TZ中，而PZ在癌症发展方面的描述更为频繁。虽然这一临床现象早已被认识到，但其潜在的原因和机制尚未阐明。因此，识别老年前列腺内的细胞和功能异质性对于理解前列腺疾病及其空间分布至关重要。

研究方法

使用3例老年人前列腺外周区（PZ）和移行区（TZ）组织进行单细胞RNA测序。并通过免疫荧光染色验证了实验结果。

研究结果

1.单细胞测序和细胞类型鉴定

通过对前列腺外周区（PZ）和移行区进行单细胞转录组测序，质控后共获得18315个细胞。这些细胞分为13个簇（图1B），通过特异性基因标注为上皮细胞(EPCAM)、内皮细胞(CD200)和两种类型的成纤维细胞[炎性成纤维细胞(iFib:PDGFRA)和肌成纤维细胞(mFib:RGS5)]、白细胞(PTPRC)和浆细胞(MZB1)，值得注意的是，BPH治疗的靶点SRD5A2仅在iFib中表达。（图1C）。EPCAM+上皮细胞被分为7个亚簇（图1D），根据标记基因和与之前发表的数据，亚簇2、3和5分别被注释为基底细胞（KRT 14）、小丘细胞（KRT 13）和俱乐部细胞（SCGB3A1）。亚群0、1、4和6被注释为管腔细胞，所有高表达的markers（KLK3）均与先前发表的管腔上皮表型相关（图1E和F）。

图1 前列腺癌的单细胞基因表达谱分析

2.四种前列腺上皮细胞类型的功能异质性

接下来通过基因集变异分析（GSVA），研究者观察到四种上皮细胞类型具有异质性。基底细胞富含细胞外基质（ECM）的功能，管腔细胞作为功能性分泌上皮细胞，与雄激素、蛋白质分泌和类固醇相关通路高度相关。值得注意的是，雄激素通路在小丘上皮细胞和俱乐部上皮细胞中并没有被高度激活，而是在干细胞、神经干、NOTCH和雌激素通路中富集（图2A）。此外，与管腔细胞和基底细胞相比，小丘细胞和俱乐部细胞表达更高水平的前列腺干细胞（如PSCA和LY6D）和神经元（如SOX2）基因，而谱系基因（如AR、KLK3和NKX3-1）在管腔细胞中表达水平更高（图2B）。免疫荧光进一步证实了干细胞神经标志物PSCA、LY6D和SOX2的共表达，而大多数AR和KLK3在KRT13（hillock）-和SCGB3A1（club）-强阳性细胞中不共表达(图2C）。为了进一步识别这四个上皮细胞亚簇的特征，研究者与之前发表的转录组相关联分析，结果发现，俱乐部细胞和小丘细胞与去势抵抗性前列腺癌祖细胞(LSCmed cells)、正常前列腺干细胞(CFSE‐high cells)和小鼠管腔干细胞(luminal 2)高度相关，与神经内分泌前列腺癌干细胞(NEPC signature)略微相关，BPH相关信号在管腔细胞中富集(图2D)。研究者应用Monocle2对细胞进行拟时序分析，俱乐部细胞和小丘细胞位于基底细胞和管腔细胞之间。值得注意的是，在俱乐部细胞和小丘细胞中观察到了大量的未剪接的RNA（图2E和图2F）。

图2 四种前列腺上皮细胞的功能异质性

3.前列腺管腔细胞间的功能异质性

管腔细胞有明显的异质性。在衰老的前列腺中观察到四个不同的管腔细胞亚群（图1D-F）。亚簇1（TFF3+）分布在PZ中，而亚簇0（KLK3+）和亚簇4（IDH1+）在TZ中富集（图3A）。免疫荧光证实，PZ比TZ含有更多的TFF3+细胞（图3B）。GSVA结果显示，TFF3+管腔细胞具有较高的MYC（如ROCK1和NPM1）和E2F（如TFF3和NAP1L1）通路活性和基因表达；KLK3+管腔细胞具有较高的雄激素和蛋白分泌功能活性和基因（如MSMB、ARG2和TMPRSS2）；其余两个亚簇（IDH1+和LTF+）表现出相似的转录组，两者都表达了重要水平的干细胞（如IDH1、PSCA和TACSTD2）和炎症（如HLA-A和HLA-DRA）通路基因（图3C和D）。GSVA分析进一步证实，在IDH1+和LTF+管腔细胞中富集了俱乐部细胞/小丘细胞特征（图3E）。基因调控网络显示，许多雄激素调控因子，如SPDEF和NKX3-1，在KLK3+管腔细胞中被高度激活，而MYC和SOX4调控因子在TFF3+管腔细胞中被激活，俱乐部细胞相关调控蛋白LTF在LTF+和IDH1+管腔细胞中富集（图3F）。

图3 前列腺管腔细胞间的功能异质性

4.外周区和移行区之 间的功能异质性

研究者对TZ和PZ中相似类型的上皮细胞间的功能进行了比较，GSVA显示，TZ中所有上皮细胞的血管生成和炎症相关通路均被激活（图4A）。值得注意的是，与PZ相比，TZ中所有上皮细胞中的干性相关基因表达丰富，而AR和管腔相关基因在PZ上皮细胞中表达丰富(图4B)。一些重要的DNA修复基因（如MSH2、APRT和POLR2I）、MYC和E2F通路基因（如NPM1、RACK1和PRDX4）在PZ管腔细胞中表达增加（图4A和C）。免疫荧光分析证实了TZ中干细胞相关基因（PSCA、LY6D和SOX2）的富集（图4D）。这些结果表明，干细胞特性的激活是区分TZ和PZ的一个重要特征，并且在PZ的管腔细胞中观察到MYC、E2F和DNA修复通路的过度激活。

图4 外周区和移行区之间的功能异质性

5.移行区的免疫微环境

在前列腺免疫微环境中，T细胞和巨噬细胞是两个主要的群体，且根据免疫荧光和scRNA-seq数据显示，中性粒细胞、NK和NK T细胞（免疫激活）和Treg细胞（免疫抑制）在TZ中富集。与PZ相比，TZ中的CD8 T细胞具有更高的细胞毒性和耗竭评分，表达细胞毒性（如GZMK，NKG7，GZMA和GZMH）和耗竭（如CCR7TCF7和CD55）基因，这也说明了TZ中具有更复杂的免疫微环境(图5B和5C)。同样地，巨噬细胞在TZ和PZ中也具有显著的功能异质性。TZ中的巨噬细胞具有较高的抗原呈递、TNF‐α和炎症途径活性，许多抗原(如HLA-DMA和HLA-C)和细胞因子(如CCL3,4和CXCL2,3,8)相关基因在TZ巨噬细胞高表达。而且一些巨噬细胞表型调控基因，如FOS/JUN等基因可增强巨噬细胞的炎症反应，IRF8，可以促进巨噬细胞向M1极化；MARCO和SPP1与巨噬细胞激活的非炎症性、免疫抑制表型相关，在TZ中更为丰富（图5D）。

巨噬细胞在免疫微环境调节中发挥重要作用，通过配体-受体相互作用分析发现在TZ和PZ中都存在大量的配体-受体相互作用，有一些独特的配体-受体相互作用，只能在TZ中观察到。巨噬细胞可以通过与受体CCR5的相互作用，进一步激活和调节CD8+T细胞，并通过CXCR2招募中性粒细胞。更重要的是，TZ中的巨噬细胞可以通过IL- 1、IL-10（有利于M1极化）和IL-6（有利于M1极化）信号通路自我调节到促炎症和抗炎状态（图5E）。最后，研究者探讨了免疫细胞对前列腺上皮细胞的影响。研究者发现，与其他类型的上皮细胞相比，免疫细胞与俱乐部细胞/小丘细胞有更多的配体-受体相互作用（图5F）。且观察到许多与增殖相关的相互作用（TNF和VEGF），在巨噬细胞和上皮细胞之间观察到大量的免疫调节相互作用（CXCR2/CXCL6、SIRPA/CD47和SPP1/CD44），表明上皮细胞可能在免疫调节中发挥作用（图5G）。

图5 TZ中复杂的免疫微环境

6.在TZ中富集的成纤维细胞的功能

研究者在前列腺组织中发现了两种类型的成纤维细胞，iFib（PDGFRA+）和mFib（RGS5+）（图6A）。iFib中富含IL6和趋化因子如CCL3、CCL2和CXCL12的表达，mFib中表达了较高水平的α-SMA(ACTA2)。差异表达基因和富集分析显示，ECM、生长因子分泌、IGF-1通路和基因在iFib中显著富集，肌纤维相关通路和基因在mFib中被激活。两种成纤维细胞都分泌各种免疫相关因子（图6B和C）。通过配体-受体相互作用分析，在成纤维细胞-上皮细胞的相互作用中，发现了常见的增殖途径，如TNF、EGF和FGF（图6D）。成纤维细胞与免疫细胞的相互作用最强（图6E）。它们表达的CXCL、CCL、HLA和CSF家族细胞因子水平升高，特别是CXCL12，其受体在免疫细胞上广泛表达（图6F和G）。

图6 TZ中成纤维细胞功能分析

研究结论

1.描述了前列腺细胞的异质性和主要的前列腺细胞类型。

2.前列腺的四种上皮细胞功能具有异质性，基底上皮细胞富含细胞外基质的功能，管腔上皮细胞为功能性分泌上皮细胞，小丘细胞和俱乐部细胞表达更高水平的前列腺干细胞。

3.前列腺管腔细胞间存在异质性。KLK3+管腔细胞为传统功能管腔细胞，具有较高的雄激素活性；TFF3+管腔细胞具有较高的MYC和E2F通路活性。

4.TZ和PZ之间存在异质性。俱乐部细胞和小丘细胞多分布于TZ区，而TFF3+管腔细胞多分布于PZ区。TZ中所有上皮细胞中的干性相关基因表达丰富，而AR和管腔相关基因在PZ上皮细胞中表达丰富，在免疫微环境中，TZ区的免疫微环境更为复杂和无序，中性粒细胞、NK、Treg细胞浸润较多。TZ的成纤维细胞密度较高，成纤维细胞功能较强。

参考文献：

Yan Q, Wang M, Xia H, Dai C, Diao T, Wang Y, Hou H, Zhang H, Liu M, Long X. Single-cell RNA-sequencing technology demonstrates the heterogeneity between aged prostate peripheral and transitional zone. Clin Transl Med. 2022 Oct.

王贝 | 文案