Proteogenomic landscape of squamous cell lung cancer

肺鳞状细胞癌的蛋白质组学景观

期刊：Nat Commun；影响因子：12.121

发表单位：H. Lee Moffitt癌症中心等 

导 读

    鳞状细胞肺癌（SCC）是常见肺癌类型之一。尽管对SCC中分子变化的认识有所提高，但对于这种变化如何导致癌症发展以及如何利用潜在的脆弱性来治疗该疾病的了解很少。H. Lee Moffitt癌症中心的研究人员仔细研究了SCC肿瘤，以确定其特征是否对患者预后产生影响，研究成果于2019年8月发表在《Nature Communications》上。

    研究团队对108个SCC肿瘤样品进行了广泛的分析，包括拷贝数变异、DNA突变、RNA和蛋白质表达模式以及病理。确定SCC肿瘤可以根据其蛋白表达模式分为3个主要的亚型：炎症、氧化还原和混合，并深入关联了各亚型的特征。炎症亚型占肿瘤组织的40％，具有与免疫细胞（尤其是嗜中性粒细胞或髓样细胞）相关的蛋白质水平较高，并具有活跃的炎症反应。基于RNA数据，炎症亚型还具有较高比例的其他免疫细胞，包括记忆B细胞和单核细胞，并且PD-1水平更高。在47％的肿瘤中发现了氧化还原亚型，特点是与氧化还原细胞信号通路相关的蛋白质含量更高。氧化还原亚型还具有更多的遗传和染色体改变，这些改变已知与SCC的发展有关，并使用这些数据作为指导确定了可能成为未来治疗目标的新漏洞。混合亚型代表了13％的肿瘤，仅表现出四种蛋白质水平的提高。研究人员没有发现该亚型的任何显著的染色体变异，但确实知道混合组比其他亚型的APC基因突变更多，基质细胞浸润更大。这三种亚型与患者的预后不同，但是在炎症亚型中更常见的三级淋巴结结构与较好的预后相关。

    研究人员希望他们的结果将有助于加深对SCC的了解，并强调每种亚型的潜在治疗靶标，提示大多数患者可以受益于针对免疫细胞类型（炎症）或肿瘤内在途径的代谢调节（氧化还原）的疗法。

摘 要

    基因组和转录组改变如何影响肺癌的功能蛋白质组尚未完全了解。本研究整合了108例鳞状细胞肺癌（SCC）患者队列中的DNA拷贝数、体细胞突变、RNA测序和表达蛋白质组学，确定了三种蛋白质组亚型，其中两种（发炎、氧化还原）占87％的肿瘤。炎症亚型富含嗜中性粒细胞、B细胞和单核细胞，并表达更多PD-1。氧化还原肿瘤富含氧化还原和谷胱甘肽途径，并携带更多NFE2L2/KEAP1突变和3q2基因座的扩增。蛋白质组亚型与患者生存率无关。然而，在炎症中较常见的富含B细胞的三级淋巴结结构与更好的生存率相关。研究确定氧化还原中的代谢脆弱性（TP63、PSAT1和TFRC），为肺SCC生物学提供了有力的资源，并基于氧化还原代谢和免疫细胞浸润提出了治疗机会。

前 言

    基因组学和转录组学技术对SCC的分子基础提供了重要的见识，产生了最初的分子分类策略。基因组和转录组的变化形成功能蛋白质组，控制免疫细胞的浸润，并呈现出可用于治疗的潜在策略，然而它们在这些分子机制中的特定作用尚待了解。为了解决这一知识不足的问题，本研究报告了一项多组学的综合分析。通过集中检查亚组的关系，讨论了从蛋白质组学创建分子分类，有助于SCC患者的治疗策略。

研究概要

1    临床分子特征和SCC蛋白质组学的肿瘤分类

    研究鉴定了108例SCC冷冻的肿瘤组织，进行靶向外显子测序、拷贝数分析、RNAseq和基于质谱的蛋白质组分析。靶向外显子组测序揭示了与TCGA患者队列相似的突变模式。蛋白表达的聚类确定了5种表达簇并归为3种亚型：2簇的通路分析揭示了免疫生物学特性，组合为炎症亚型；2簇显示出清晰的氧化还原生物学，组合为氧化还原亚型；1簇包括与Wnt基质信号传导相关的生物学，归类为混合亚型。炎症和氧化还原是主要的亚型，占患者队列的87％。

图1，蛋白质组的聚类分析将108例SCC患者肿瘤归为3种生物亚型（炎症、氧化还原和混合）。上方热图显示突变状态和常见突变的SCC基因/基因座的拷贝变化，下方热图显示蛋白表达的聚类分析及通路富集。

2    SCC蛋白质组与转录组的关系

    首先将蛋白质组学亚型与前人报道的SCC基因表达特征进行比较，观察到一致的结论。炎症蛋白质组学亚型主要由分泌型（免疫）和基础型（细胞粘附）组成，氧化还原亚型主要由新陈代谢组成，而混合亚型包括基础、分泌性和原始肿瘤的混合模式。为了进一步研究与转录组和蛋白质组有关的生物学基础，作者比较了转录蛋白对的通路富集。高度相关的转录蛋白对富集了中性粒细胞、细胞外基质、细胞凋亡、氧化应激和糖酵解途径；弱相关的对富集了无意义介导的衰变和翻译相关的机制，表明这些功能在转录后和翻译水平上受到更多的调节。

3    炎症亚型富含浸润性免疫细胞，并具有增加的PD-1基因表达

    蛋白质组学分析表明了炎症亚型中的免疫功能，继续使用RNAseq数据推断浸润细胞的类型。与蛋白质组学观察一致，炎症亚型的免疫分数中位数最高，记忆B细胞、单核细胞和嗜中性白细胞的比例更高，浆细胞比例明显较低。为了检查免疫检查点抑制剂治疗的意义，还检查了RNAseq数据中PD-1（PDCD1）和PD-L1（CD274）的表达。炎症亚型的PD-1 mRNA表达明显高于氧化还原和混合肿瘤，但PD-L1没有差异性表达。这些结果表明，炎症亚型的肿瘤对观察到的蛋白质组表达具有更多的免疫细胞类型贡献。

    作者猜测嗜中性粒细胞签名可能不仅包括成熟的嗜中性粒细胞，而且还包括髓样来源的抑制细胞、单核细胞和巨噬细胞。这一点对免疫疗法可能会产生重要的影响，因为研究发现嗜中性粒细胞在肺癌的免疫环境中占主导地位，并具有淋巴细胞抑制能力。进一步分析发现，发炎时中性粒细胞明显升高。通过对肿瘤内和基质CD33进行评分，在肿瘤基质中观察到更多的CD33阳性细胞，表明靶向CD33阳性的髓样细胞可以通过从肿瘤微环境中消除免疫抑制细胞来潜在地增强免疫检查点治疗。

图2，炎症亚型肿瘤的免疫浸润分析。a，差异蛋白的功能富集，炎症亚型富含包括中性粒细胞脱粒在内的免疫途径；b-d，不同算法估计的免疫得分；e-o，3种蛋白质组学亚型之间的免疫亚型比较。

4    炎症亚型的肿瘤具有较少的关键基因突变和较少的染色体改变

    接下来作者分析了基因突变或拷贝数变异是否与炎症肿瘤有关，观察到NFE2L2、KEAP1和APC显著突变。TP53突变的发生率在发炎时有所降低，并通过TCGA数据支持。炎症亚型存在14q3扩增增加，但3q2、2q3、12p1和17q2的扩增减少。与其他亚型相比，发炎的3p1损失显著减少，但频繁变化区域的缺失却不明显。这些结果与另一项韩国SCC队列中拷贝数变异与免疫评分负相关的报道一致。

5    三级淋巴结结构与预后改善相关

    作者还测试了三种蛋白质组学亚型与的临床、病理学和预后数据之间的关联性，总体或无复发生存率没有显著差异。考虑到在炎症亚型的肿瘤中观察到的免疫表型，认为这可能与更好的预后相关。作者假设在这些肿瘤的组织学特征中还将观察到发炎亚型的免疫特征。发炎时记忆B细胞显著高于其他人群，CD20免疫组化分析显示癌组织附近的淋巴样细胞聚集体与三级淋巴结（TLN）相一致，TLN在发炎时更丰富。TLN对CD20表现出很强的染色，表明存在高浓度的B细胞。RNAseq显示出B细胞标记物BLK、CD79A和CD79B的较高表达，蛋白质组学显示B细胞标志物IGLL1的较高表达。这些结果表明，富含B细胞的TLN而非浸润的B细胞数量与手术切除的SCC的更好生存相关，免疫细胞浸润的模式及其有组织的结构目前比基因突变，转录组或蛋白质组学更有效地确定患者的预后。

图4，三级淋巴结（TLN）富含炎症亚型，并具有更好的预后。a、b，蛋白质组亚型与总体生存或无复发生存无关；c，H＆E染色观察，红色框表示的TLN；d，TLN可以在所有三种蛋白质组亚型中观察到，但在炎症亚型中更富集；e、f，TLN的存在为整体生存和无复发生存都带来了好处；g、h，免疫组织化学染色显示TLN主要由CD20阳性记忆B细胞组成。

6    蛋白质组是由NFE2L2/KEAP1复合体中的基因组改变驱动的

    氧化还原亚型中显著升高的蛋白质包括5个AKR家族成员，在转录水平上也存在差异表达，以及TP63表达水平的升高。氧化还原亚型富集了氧化还原、谷胱甘肽合成和角化途径，肿瘤的拷贝数增加和损失最多，并确定了与拷贝数变异以及NFE2L2和KEAP1突变的强烈关联。还观察到NFE2L2信号传导的下游效应，包括氧化应激和谷胱甘肽途径。KEAP1是一种E3连接酶，具有多种底物，包括NFE2L2。因为KEAP1泛素连接酶活性的丧失可能导致底物的积累，具有KEAP1突变的肿瘤富集NFE2L2独立的共表达，通路分析确定了有丝分裂细胞周期相变的调控。鉴于SOX2、TP63和NFE2L2转录程序在SCC生物学中的重要性，作者还检查了mRNA转录物-蛋白质的相关性。与炎症亚型相比，氧化还原亚型中的SOX2转录程序翻译更为一致。

图5，氧化还原亚型富集氧化应激途径和NFE2L2/KEAP1的改变。a，差异蛋白的功能富集，氧化还原亚型富集了氧化还原和角化途径。b，43个氧化还原肿瘤具有NFE2L2或KEAP1的至少一个基因组改变；c，通过NFE2L2或KEAP1突变对患者进行分层；d、e，DNA拷贝数与蛋白质相关性和RNA与蛋白质相关性；f，高度相关的基因与来自氧化还原亚型的显著升高的蛋白和DRIVE目标基因的交集；g- l，鳞状细胞肺癌细胞系的DRIVE结果。

7    TP63和NFE2L2相关蛋白PSAT1是SCC的薄弱环节

    作者假设可以通过将高度相关的DNA拷贝数/ mRNA /蛋白质变化与SCC细胞系中的RNA干扰筛选数据相结合来确定SCC治疗靶标。产生相应更高数量蛋白质的扩增基因可能是疾病的驱动因素，并且可能代表可以通过治疗干预加以利用的脆弱性。由于明确的基因组驱动因子NFE2L2和KEAP1的发现，确定了代谢相关的途径，因此将分析重点放在了氧化还原亚型上。拷贝数与蛋白质相关性和转录物与蛋白质相关性分析鉴定出94个在氧化还原亚型中显著升高的独特蛋白。进一步结合DRIVE项目中提取的siRNA数据，识别可能的靶向分子AKR1C3、PSAT1和TP63。PSAT1和TP63与代谢信号传导生物学相关，并在SCC中构成潜在的脆弱性，表明治疗氧化还原亚型的肿瘤可以靶向代谢途径。

8    SCC的混合亚型与Wnt信号相关，并增加了基质浸润

    混合亚型在氧化还原和中性粒细胞途径中表现出显著降低。混合亚型散布在发炎和氧化还原的两个簇之间，只有四个蛋白质在该亚型中显著增加，CHRAC1、FN1、MARCKSL1和FHL2，其中FN1、MARCKSL1和FHL2可以直接绑定到Wnt/β-catenin信号传导。混合亚型具有明显更多的APC突变，没有发现与混合亚型相关的复制损益的显著富集。混合肿瘤的中位基质得分最高，肿瘤基质已显示出分泌Wnt配体激活癌细胞中的Wnt信号。

图6，混合亚型具有与Wnt /基质信号传导相关的生物学特性。a，混合中没有显著升高的途径，但是减少了免疫途径和氧化还原途径；b，三种亚型的主成分分析；c，APC突变示意图。

讨 论

    综上所述，研究者采用质谱蛋白质组学、DNA和mRNA平行分析相结合的方式对鳞状细胞肺癌样本进行了分子分型，并确定了驱动这些肿瘤的关键基因的改变。这是目前对肺鳞状细胞癌基因组学、转录组学和蛋白组学数据最深入的分析。