非因重磅 | 非因生物发表国内第一篇DSP研究性文章
非因生物联合北京大学肿瘤医院在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》杂志上（IF：5.89）发表国内第一篇DSP空间多组学研究性文章（图1）。这是非因生物发表的继国内第一篇DSP技术性文章和第一篇DSP综述性文章（见文末）后的第三篇DSP空间组学论文。
该文章利用非因DSP空间多组学技术，仅用4例III期结直肠癌（CRC）样本，分别对肿瘤微环境中40重蛋白表达图谱和84重mRNA转录图谱进行空间多靶标检测及共分析，以期发掘潜在的生物标志物，并为CRC免疫治疗新方法的有效性提供理论依据。
图1
研究背景
多项临床试验已经证明了免疫治疗在延长晚期结直肠癌(CRC)患者生存期上的有效性，然而由于肿瘤微环境（TME）的复杂性和异质性，对其治疗有效的原因还不甚了解。本文通过DSP技术将空间信息和High-plex 多组学数据进行联合，对复杂的肿瘤微环境进行深入剖析，进一步阐明CRC免疫治疗的机制。
研究亮点
非因团队通过DSP空间多组学技术，将4例CRC患者样本：2例患者单独接受新辅助化疗、2例患者接受新辅化疗联合免疫治疗，进行肿瘤和基质区域的划分，然后对其进行40重蛋白和84重mRNA表达谱分析，再与不同治疗方式相关联，得到肿瘤和基质的区域特异性表达模式（在2020年初非因团队开始这项研究时，DSP空间多组学技术刚刚问世，只具有分析40重蛋白和84重mRNA的能力。而目前非因DSP空间多组学技术已经扩展到可以分析多至100种蛋白和18,000种mRNA，分析能力比研究初期提高了数倍）。
非因DSP空间多组学技术解决了传统分析平台无法同时获取形态学信息和多重靶标表达数据的难题，可在单张石蜡包埋组织切片（FFPE）或者新鲜冷冻切片上实现原位检测100重蛋白靶标或人类（18000多个蛋白编码基因）/小鼠（21000多个蛋白编码基因）的全转录组分析，是专门针对肿瘤免疫和肿瘤微环境高精度、多维度分析的新技术。
研究思路
研究结果
1、DSP在CRC组织中的验证
mRNA和蛋白质在肿瘤和基质区的表达谱显示出强烈的区域特异性，而不受单个组织特征和不同治疗方式的影响（图2C和D)。肿瘤区ROIs的mRNA数据可以清楚的区分接受不同治疗方式的患者，这表明在肿瘤富集的TME中存在潜在的免疫信号（图2C）。
在基因关联分析中，免疫（CD3、CD4、CD8、CD14和CD163）和上皮细胞标记物（AKT1、Cytokeratin、EPCAM、Ki-67和S6）在mRNA和蛋白水平上各自的显著相关性，表明这些标记物在特定微环境中表达趋势的总体一致性。
图2
2、区域定义的CRC患者个体分子特征
基于ROI的选择策略，非因团队对治疗组内和组间的肿瘤周围基质区和肿瘤上皮区进行比较。化疗患者（患者1和2）肿瘤富集区的免疫标记物在mRNA和蛋白水平上整体低表达，说明较低的肿瘤浸润以及免疫相关细胞大都存在于基质中（图3A和B）；两名患者明显的mRNA表达差异仅在肿瘤富集区被发现（图3C）。当比较17个共有基因时，在相同的ROI分析中，没有在蛋白质水平捕获mRNA的差异表达，说明了蛋白质组学数据在补充转录组学数据中对患者进行区分的重要性。
研究同样发现，联合治疗（患者3和4）诱导了多种免疫细胞进入肿瘤区域，表现为肿瘤区ROIs中许多免疫标记物和细胞因子在mRNA和蛋白水平上的高表达，包括CD4、CD68、GZMB、CD40LG（CD40配体）、CD86、CD276和LAG3（图4A和B）。
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其中肿瘤特异性PD-L1在mRNA和蛋白水平上表达显著增加（图4C和D），并通过免疫组化（IHC）进行了验证（图4E）。值得注意的是，CD45只在蛋白水平上增加（图5E），这表明需要同时在蛋白组和转录组的水平上评估TME。此外，基质ROIs分析发现化疗组中STING（干扰素应答刺激因子CGAMP交互因子1）和CD14蛋白表达增加，这是单独化疗药物存在免疫排斥的标志（图5F和G）。
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接着，非因团队对两类患者肿瘤区的表达谱进行无监督和PCA分析，发现mRNA表达谱与治疗方案密切相关（图6A和C）。同时基质区mRNA水平上的无监督聚类和PCA分析也得出了两个不同的治疗组（图7A和C）。当肿瘤和基质混合时，无法观察到这些ROI区域定义的分组（图7D和E），说明了研究空间信息对患者区分和生物标志物发现的必要性。
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3、mRNA和蛋白质的DSP分析揭示了治疗方法的差异性
为了解mRNA和蛋白质之间的动态变化，非因团队在亚组织分辨率下比较了相同区域内共有mRNA和蛋白靶标的表达谱。根据17个共有靶标在个体ROI中的表达相关性进行绘制（图8A），转录组和蛋白组之间的总体表达相关性中等（R2=0.58, p<0.05），其中PD-L1、CD4和VISTA等基因在RNA和蛋白质水平上呈高相关，而CTLA4、FOXP3和GZMB呈低相关（图8B）；同时转录组和蛋白组的相关性在治疗组之间也存在差异，化疗组的相关性总体高于联合治疗组（图8C-E）。这些研究表明，转录信息并没有在蛋白质水平上完全执行其生物学功能，因此，翻译后修饰可能在特定的细胞环境中发挥关键作用。
图8
研究总结
本研究对4例III期CRC患者样本进行了空间蛋白组和转录组多靶标分析，为晚期CRC患者的免疫治疗机制和生物标志物的发现提供了新见解，并用同一治疗方式下的连续切片比较了mRNA和蛋白质之间的生物学差异。文章中的主要发现包括联合治疗的CRC患者PD-L1在mRNA和蛋白水平均高表达，并通过免疫组化染色证实，从而能够区分肿瘤和间质区相关的特异性表达谱。高水平的PD-L1（CD274）在特定的肿瘤微环境中可能引发更好的免疫原性反应。
虽然文中的研究在一定程度上受到患者数量的限制，但是由于ROI技术的精确性以及基于ROI的个体数据集已被证明在技术和生物学上的有效性，使得能够在TME中比较特定区域内的蛋白和mRNA表达差异，这在CRC以往的研究中还未以如此精细的方式进行。
综上所述，非因团队通过DSP技术，对4例晚期CRC患者的40 重蛋白和84 重 mRNA的表达谱同时进行多靶标高分辨率的分析，为CRC肿瘤微环境的研究提供了有价值的资源和初步数据。
