• 很接近bowtie2与bwa

1. 基本流程

1.1. 建立参考基因组
hisat2-build
可为UCSC、NCBI、Ensembl等来源的fasta文件，多个文件以逗号分隔
1.2. 比对样本reads
hisat2
输出为SAM文件
1.3. 下游SAMtools/BCFtools分析
samtools view将SAM转化为BAM
samtools sort将BAM转化为sorted BAM
sorted BAM方便长期储存
samtools mpileup，bcf view产生VCF文件

2. 安装搭建

下载链接：
HISAT2：Download | HISAT2 (daehwankimlab.github.io)
NCBI-NGS：https://github.com/ncbi/ngs/wiki/Downloads

1. 下载后解压，转到当前目录后make
2. HISTAT2可直接支持sra数据，需要安装NCBI-NGS，make并设置参数如下:

make USE_SRA=1 NCBI_NGS_DIR=/path/to/NCBI-NGS-directory NCBI_VDB_DIR=/path/to/NCBI-NGS-directory

3. 将一下所有路径添加进PATH：hisat2, hisat2-align-s, hisat2-align-l, hisat2-build, hisat2-build-s, hisat2-build-l, hisat2-inspect, hisat2-inspect-s and hisat2-inspect-l

3. 函数的书写

一些选项的参数不是常数，而是输入一个函数。所以有特定的函数表达方式如下：
参数：F、常数：C、系数：A
函数类型：L线性、C常数、S平方根、G log
示例：L,-0.4,-0.6等同于f(x) = -0.4 + -0.6 * x、G,1,5.4等同于f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)

4. indexer

短于4 billion nucleotides的参考序列，建立32-bit的small index，扩展名.ht2
较长时，建立64-bit的large index，扩展名.ht2l
wrapper scripts会自动区分处理两种index
running time 和 memory usage之间的平衡-p/--packed, --bmax/--bmaxdivn, 和 --dcv
hisat2-build会自动选择时间和内存的平衡点，-a/--noauto可取消
4.1. 主要参数
-f：<reference_in>：逗号分隔的fasta文件，-c输入序列
<ht2_base>：indexer输出文件
4.2. 其他参数

• 涉及很多比对原理
  --large-index：强制作large index
  -a/--noauto：自动选择下面两个参数
  --bmax：一个格子里更多序列
  --bmaxdivn：一个格子里更多参考组百分比
  --dcv：difference-cover sample，越大，占内存越小，索引更慢
  --nodc：difference-cover sample关闭
  -r/--noref：不创建NAME.3.ht2 and NAME.4.ht2，bitpacked参考序列，主要用于双末端比对
  -3/--justref：只创建NAME.3.ht2 and NAME.4.ht2
  -o/--offrate：在不同的基因位置做标记，越大速度越快，内存占的越大。默认4
  -t/--ftabchars：为基因位置作ftab，越大速度越快，内存越大。默认10
  --localoffrate：为local index做标记
  --localftabchars：为local index作ftab
  -p：多线程，默认1
  --snp：提供snp信息（HISAT2自建的格式）
• 网站提供了脚本从dbSNP file和 VCF file提取
  --haplotype：提供haplotype信息（HISAT2自建的格式），上述脚本也可用
  --ss：提供splice site信息（HISAT2自建的格式）
• 提供了脚本从GTF文件提取splice sites
  --exon：提供exons信息（HISAT2自建的格式）
• 提供了脚本从GTF文件提取exons
  --seed
  --cutoff：忽略参考组的前几个碱基
  -q/--quiet：只报错
  -h/--help：Print usage information and quit.
  --version：Print version information and quit.

5. 比对

HISAT2默认会soft-clip，即将一些5端与3端的碱基惩罚降低。
--sp设置惩罚值，--no-softclip可取消soft-clip
5.1. 主要参数（输入与输出）
-x：index file 不需加后缀
-1：read1 需要后缀
-2：read2
-U：unpaired reads
--sra-acc：sra accession number
-S：SAM output
5.2. 输入参数
-q：输入是fastq
-qseq：输入是qseq文件
-f：fasta文件
-r：一个序列一个文件
-c：命令行直接输入，逗号分隔序列
-s/--skip：跳过一定reads
-u：仅比对一定reads
-5：5端切碱基
-3：3端切碱基
--phred33：碱基质量格式
--phred64：碱基质量格式
--solexa-quals：Solexa转为phred
--int-quals：数字格式质量分数
5.3. 比对参数
--n-ceil：输入函数，根据read长度设置N上限，默认L,0,0.15
--ignore-quals：计算mismatch惩罚时，默认忽视该碱基的质量分数
--nofw/--norc：
5.4. 评分参数
--mp MX,MN：惩罚分数，默认6，2
--sp MX,MN：soft-clip惩罚分数，默认2，1
--no-softclip：
--np：N惩罚，默认1
--rdg：read gap和extend惩罚，默认Default: 5, 3
--rfg：reference gap和extend惩罚，默认5, 3
--score-min： 输入函数，根据read长度设置valid比对的下限，默认L,0,-0.2

• bowtie2写的比较详细，建议去看一下
  5.5. 剪切点（splice sites）惩罚
  5.6. 报告参数
  -k：报告k个比对序列，值得注意的是HISAT2的匹配并非匹配到最优匹配，仅仅是找到较合适的匹配
  --max-seeds：seed-and-extend approaches，越大，运行越慢。默认值时maximum of 5 and -k为2
  -a/--all：报告所有比对结果，等同于--max-seeds、-k均设置为最大值
  5.7. 双末端
  -I/--minins：最短匹配长度
  -X/--maxins：最长匹配长度，与-X差别越大，运行越慢，因为需要更细致的比对
  --fr/--rf/--ff：定义双末端匹配方式，--fr为默认，较适合Illumina
  --no-mixed：默认若找不到paired匹配，则为单末端寻找匹配，该选项可取消
  --no-discordant：默认为双末端各自寻找匹配，该选项可取消
  5.8. 输出参数
  -t/--time：输出wall-clock time
  --un, --un-gz, --un-bz2：输出unpaired reads
  --al, --al-gz, --al-bz2：输出unpaired reads that align at least once
  --un-conc,--un-conc-gz,--un-conc-bz2：输出paired-end reads that fail to align concordantly
  --al-conc,--al-conc-gz,--al-conc-bz2：输出paired-end reads that align concordantly at least once
  --quiet：不输出
  --summary-file：alignment summary
  --new-summary：alignment summary in a new style, which is more machine-friendly
  --met-file
  --met-stderr
  --met
  5.9. SAM参数
  --no-unal：不输出没比对上的序列
  --no-hd：不输出header
  --no-sq：不输出@SQ header
  --rg-id：SAM添加@RG header
  --rg：添加@RG header
  --remove-chrname：去除‘chr’这三个字母
  --add-chrname
  --omit-sec-seq
  5.10. 运行参数
  -p：多线程
  --reorder：SAM ordered，会导致跑得慢
  --mm：Use memory-mapped I/O to load the index, rather than typical file I/O
  --seed：pseudo-random number generator，默认0
  --version：Print version information and quit.
  -h/--help：Print usage information and quit.

6. index inspector

提取index的信息，以及参考组信息
-a/--across：每行多少个碱基
-n/--names：输出参考序列名
-s/--summary：输出参考序列信息
--snp：Print SNPs, and quit.
--ss：Print splice sites, and quit.
--ss-all：Print splice sites including those not in the global index, and quit.
--exon：Print exons, and quit.
-v/--verbose：Print verbose output (for debugging).
--version：Print version information and quit.
-h/--help：Print usage information and quit.