15.PacBio测序

PacBio SMRT技术以SMRT芯片为测序载体，应用边合成边测序的思想进行测序，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。

原理

测序用的4种碱基分别被4色荧光标记，当DNA聚合酶和模板结合后,在碱基配对阶段，不同碱基的加入会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。
PacBio SMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来，他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理。如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔，小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰；如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔， 即 ZMW(零模波导孔)的外径仅有 100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。

PacBio SMRT技术原理.png

特点

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。