干货｜DNA甲基化测序后的后期验证方法

做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。

一、简单验证

目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）

DNA甲基化干扰：

DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达

DNA甲基化抑制剂

阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。

检测整体DNA甲基化变化：

5mC甲基化免疫荧光染色（定性）

DNA斑点杂交（定性）

比色法（定量）

]质谱法（定量）

检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证

目的基因DNA甲基化的干扰：

荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。

检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS

检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR

检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

检测细胞功能受到的影响:

免疫荧光显微观察

功能标志物测定

... ...

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术

目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）

靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。

超高深度：可达几百到几千乘。

单个区域长度<300bp

需要设计BS引物，进行预扩增实验。

WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR

参考文献：

① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI10.1186/s13148-017-0430-7

② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841

③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z