电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备

2022-09-15 本文已影响0人实验小助手

一、材料和试剂

恒温旋转式摇床

三角烧瓶（容量为1或2L）

50ml灭菌离心管

低温高速离心机

SB培养基

细菌培养用胰化蛋白胨 20g

细菌培养用酵母提取物 5g

NaCl 0.5g

去离子水 950ml

250mmol/L KCl溶液 10ml

以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0，加去离子水至1L，高压蒸气灭菌。

20%葡萄糖溶液

1mol/L MgCl2溶液

10%甘油

二、操作步骤

从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆，接种于10m1 SB培养基中。

37℃摇床培养过夜。

取2.5ml培养物转接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。

37℃培养直到OD600=0.7～0.8。

将培养物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃离心20min，弃上清。

将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中，4000r/min于4℃离心20min，弃上清。

重复第（6）步骤。

将菌体重悬于15ml 10%甘油，并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml细菌。迅速地将其吹打重悬；

分装成200μl或40μl 的小份，操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。