GEO芯片分析中的大坑，差异基因完全相反！

昨晚上吐下泄，今天躺在床上一整天，到了晚上才好一点，强撑着写一篇帖子，flag不能破啊。

GEO的芯片分析，可以看一下这一篇。
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GEO的芯片分析，一到了差异分析部分，几乎没有悬念，因为其中的步骤都是limma包的作者定义的，我们没有修改的空间，这里面常见的坑就是，

差异分析的结果会完全相反，原本高表达的会变成低表达。

不懂内在逻辑的时候，想要正确完全靠的是运气，主要看两组的命名，比如，一个3vs3的实验，我们的分组是这个样子的。

group <- c(rep("con",3),rep("treat",3)) 

前面三个是control，后面三个是treat。这时候，算出来的结果就是treat比上control，没有问题。因为默认情况下因子的排序是按照字母的前后顺序排列的，control在treat之前。
如果我们把两组命名为，cancer 和normal

group <- c(rep("cancer",3),rep("normal",3))

那么由于n在c的后面，所以最终的结果会变成normal比上cancer，所以的差异基因变化值都会相反。
如何 避免呢？这里要用到因子的排序。只要每次在levels里面，把真实的对照组放在前面就可以了。

group <- c(rep("con",3),rep("treat",3)) 
group <- factor(group,levels = c("con","treat"),ordered = F)

换一个名字也是一样的，只要把对照组放在前面即可

group <- c(rep("treat",8),rep("vector",10)) 
group <- factor(group,levels = c("vector","treat"),ordered = F)

设置了分组后，接下来的操作是固定的

## 1.构建比较矩阵
design <- model.matrix(~group)
## 比较矩阵命名
colnames(design) <- levels(group)
design
#2.线性模型拟合
fit <- lmFit(exprSet,design)
#3.贝叶斯检验
fit2 <- eBayes(fit)

最终只有输出差异基因的时候要强调一下,coef要选择2。

allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',coef=2,number=Inf) 

其中，group不一定是要很整齐的前面是对照，后面是处理，样本的顺序可以是乱的。比如这一篇中的group也是可以的。
GEO的样本名称太多而且排序不规则，你们都是手动分组的么？

明天我们介绍一下limma包中的多组差异分析，三组并不需要算三次，一次就可以了。