Nature| cGAS功能新发现：核内cGAS抑制DNA修复，
上周得知李咏去世的消息，大家很是震惊感叹，网上出现各种防癌指南，有人突然有些恐慌，赶紧去做各种体检，或调整饮食生活方式。
你知道吗？我们每天暴露于各种各样的内外因素中，如紫外线、辐射、化疗药物、病毒感染等，DNA难免会遭受各种各样的损伤。据估计人类每个细胞每天要遭受约70000处损伤【1】，如果没有良好的修复机制，我们的细胞早就癌变了。不过不用担心，正常状态下体内的DNA修复机制足以处理这些损伤，但当DNA的修复机制出现问题时，就极有可能增加细胞的癌变倾向。
据预计DNA修复功能受损时DNA的损伤和突变频率【1】。
2018年10月24日同济大学医学院、同济大学附属肺科医院戈宝学教授与同济大学生命科学与技术学院、同济大学附属第一妇婴保健院毛志勇教授研究团队合作在在Nature杂志发表了题为Nuclear cGAS suppresses DNA repair and promotes tumorigenesis的研究成果，首次发现核内cGAS能够抑制DNA修复，促进肿瘤生成【2】，这一发现或许能为肿瘤的治疗提供新靶点。该研究结果同时被Nature Reviews Molecular Cell Biology杂志作为亮点研究报道【3】。
下面我们一起来精读这篇文章，学习作者的套路吧。
ＮＯＷ现在行动！
背景介绍
我们知道，正常情况下，DNA只存在于细胞核和线粒体中，当DNA出现在细胞质中，则意味着出现了异常。
环状GMP-AMP合成酶（cyclic GMP-AMP Synthase, cGAS）是2012年陈志坚课题组【4】鉴定到的一个酶，它能够感受到细胞质DNA的存在，并激活下游的炎症反应。胞质DNA与cGAS结合，诱发cGAS的催化中心发生构象改变，把GTP和ATP转化为环鸟腺苷酸（cyclic GMP-AMP, cGAMP）。cGAMP是接头蛋白STING（Stimulator of IFN Gene）的高亲和力配体，可以结合并激活STING，激活下游的I型干扰素和炎症因子。
cGAS-cGAMP-STING信号通路的示意图【5】。
方法与结果
1 DNA损伤引起cGAS核转位增加
为了验证DNA损伤条件下cGAS是否有变化，作者用依托泊苷（etoposide）、喜树碱（camptothecin）和过氧化氢（H2O2）三种基因毒性药物处理三种人成纤维细胞，均发现基因毒性药物引起的DNA损伤可使cGAS核转位增加。
此图为原文Extended Data Fig. 1。NT表示未用基因毒性药物处理（untreated）。b-d 图分别为三种基因毒性药物处理HCA2-TERT细胞后cGAS的免疫荧光照片，可以看到与未处理组a 图相比，cGAS入核明显增加。e 图是a-d 图的定量。f-i 图与a-d 图类似，只不过免疫荧光检测的是HA标记的cGAS。α-laminA/C染色证明核膜的完整性。j-m 图是用两个捐赠者的皮肤成纤维细胞做相应的处理，n 图是相应的定量。o 图是细胞流式技术检测细胞凋亡，CCCP是阳性对照，与NT组比，基因毒性药物处理组细胞凋亡改变不显著。
此图为原文Fig. 1b。作者对依托泊苷处理的HCA2-TERT细胞的核、质分别进行WB，可见随着依托泊苷处理时间的延长，细胞核的cGAS逐渐累积。
此图为原文Extended Data Fig. 2。作者在A549和PC-9两种肺癌细胞株上进行实验，同样观察到基因损伤药物可导致cGAS核转位增加，而且呈时间和剂量依赖效应。
2 cGAS核转位依赖于其Y215位点的磷酸化
背景介绍中提到cGAS的经典功能是感知细胞质DNA，并进一步引发下游炎症反应，这一功能的发挥依赖于cGAS的DNA结合域和酶学功能域。
那么DNA损伤引起的cGAS核转位增加是否也依赖于这两个功能域呢？
作者定点突变这两个结构域，结果显示cGAS核转位的增加不依赖于cGAS的DNA结合域和酶学功能域，这意味着cGAS核转位的机制跟经典的cGAS-cGAMP-STING信号通路走的不是同一条路。
此图为原文Extended Data Fig. 3。作者定点突变cGAS的DNA结合域和酶学活性域后再用依托泊苷处理细胞，观察cGAS的核转位变化，a 图为免疫荧光图片，b 图为相应定量图，其中第一列为WT对照，第2-3列为酶学活性域定点失活突变，第4-6列为DNA结合域定点突变，可以看到与WT相比，突变DNA结合域和酶学活性域未能显著影响cGAS的核转位。
那么cGAS的核转运增加依赖于哪一个位点呢？
cGAS第215位的酪氨酸（Y215）是个高度保守的位点，作者发现将该位点的酪氨酸突变后能明显抑制DNA损伤后cGAS的核转位，而且突变后酪氨酸的磷酸化水平明显降低。
此图为原文Extended Data Fig. 4a-e。a 为保守性分析，黄色高亮为保守序列，红色高亮为绝对绝对保守序列。△标注的即是Y215位点。b-e 图显示Y215E突变后，用基因毒性药物处理PC-9细胞，cGAS核转位水平未明显增加。
此图为原文Fig. 1c-e。c-d 图为依托泊苷处理PC-9细胞4h后WT型和Y215E组cGAS核转运的变化，与Extended Data Fig. 4b-c 差不多。e 图显示Y215A突变后cGAS的磷酸化水平明显降低。
左图为原文Fig. 1f，右图为原文Extended Data Fig. 4g。这两幅图想说明Y215的磷酸化水平逐渐降低伴随着DNA损伤后cGAS的核转位增加，从而推测Y215的磷酸化参与调控cGAS的核转运。然而学霸看图只能得出随着Y215的磷酸化水平逐渐降低，细胞cGAS的水平逐渐增加，不知道是细胞核的cGAS增加还是细胞质的cGAS增加，β-actin应该是细胞质的内参。可能是学霸没太看懂。你看此图能得出作者的结论吗？欢迎你告诉学霸。
3 BLK负责cGAS Y215位点的磷酸化
既然作者怀疑Y215的磷酸化参与调控cGAS的核转运，那么就要找出控制Y215位点磷酸化的激酶。
作者构建了靶向89个酪氨酸激酶的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）文库，观察其对cGAS核转运的影响，结果发现B淋巴酪氨酸激酶（B-lymphoid tyrosine kinase, BLK）的敲低能明显增加cGAS的转运，同时伴随cGAS磷酸化水平的降低。
将cGAS Y215E位点突变后，再敲低BLK，用基因毒性药物处理，细胞的cGAS核转运水平与未敲低BLK组相比无明显变化。以上说明BLK通过维持cGAS Y215位点的磷酸化使cGAS定位于细胞质，而基因毒性药物促使cGAS Y215位点去磷酸化，从而便于cGAS向细胞核转运。
此图为原文Fig. 1g-l。h-i 图显示敲低BLK后，基因毒性药物处理后的cGAS核转运明显增加。j 图显示敲低BLK后，随着依托泊苷处理PC-9细胞时间的延长，cGAS的磷酸化水平明显降低，未敲低BLK组p-cGAS也有随依托泊苷处理时间延长逐渐降低的趋势，但变化不及敲低BLK组显著。k-l 图显示cGAS发生Y215E定点突变后，敲低BLK，基因毒性药物处理后的cGAS核转运水平与未敲低组相比无明显变化。
此图为原文Extended Data Fig. 4h-j，是敲低BLK后用喜树碱处理PC-9细胞的结果，结论与上图一致。
4 cGAS依赖NLS2序列与导入蛋白进行核转位
cGAS包含2个核定位序列（nuclear localization sequences, NLS），提示cGAS的核转位可能是一个经典的依赖导入蛋白（importin）的过程。
Co-IP证实cGAS与导入蛋白α家族的KPNA1~KPNA5存在相互作用。分别删除NLS1和NLS2序列，发现删除NLS2序列后能够解除cGAS与KPNA2之间的相互作用，且能够抑制DNA损伤引起的核转位，提示cGAS依靠NLS2序列与导入蛋白相互作用进行核转位。
此图为原文Extended Data Fig. 5。a 图展示cGAS的两个NLS序列，b 图显示NLS2序列的保守性。c 图为Co-IP。d 图显示删除NLS2序列后明显抑制cGAS与KPNA2的相互作用。e-j 图显示删除NLS2序列后明显抑制基因毒性药物引起的cGAS核转位。k-p 图是用导入蛋白β家族的抑制物Importazole处理细胞，能明显抑制基因毒性药物引起的cGAS核转位。
5 γH2AX促进cGAS被招募到DNA损伤位点
DNA损伤后会引起cGAS核转位，那么cGAS具体转位到细胞核中哪个位置呢？
激光微辐射显示cGAS被招募到DNA损伤处，染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验进一步证明cGAS被招募到双链DNA损伤处（double-stranded breaks, DSBs）。
H2AX（H2A histone family member X）是H2A家族的一种组蛋白，当DNA发生DSBs时，H2AX 的S139位点会发生磷酸化，转变为γH2AX，参与DNA损伤的修复，因此γH2AX是DSBs的一个很好的标志物。
作者运用Co-IP发现cGAS与γH2AX存在相互作用，且DNA损伤能增强其相互作用。通过deletion analysis，作者证明cGAS通过其羧基端（氨基酸213-522）与γH2AX相互作用，而γH2AX的S139位点是cGAS与γH2AX相互作用不可缺少的。作者通过无标记生物分子相互作用技术（label-free biomolecular interaction assay）进一步证明S139位点的磷酸化cGAS与γH2AX相互作用的必要条件。
免疫荧光显示cGAS与γH2AX共同定位于DNA损伤位点，而用shRNA敲低H2AX后能够抑制cGAS被招募到DNA损伤位点。
以上说明γH2AX能够促进cGAS被招募到DNA损伤位点，并通过S139位点与cGAS直接发生相互作用。
此图为原文Fig. 2a-d。a 图是激光微辐射损伤U2OS细胞后，GFP标记的cGAS被招募到DNA损伤位点的动态图。b 图用I-Scel酶处理细胞造成DSBs，然后用ChIP证明I-Scel酶处理4h后，cGAS明显富集于DSBs处。c 图是不同浓度的cGAS 与γH2AX相互作用的动力学图。d 图显示cGAS与γH2AX共同定位于DNA损伤处。
此图为原文Extended Data Fig. 6。a 图是Co-IP证明依托泊苷处理后H2AX与cGAS和γH2AX存在相互作用，b 图用Co-IP证明依托泊苷处理后γH2AX与cGAS存在相互作用。c 图显示依托泊苷和H2O2处理后H2AX与cGAS和γH2AX的相互作用增强。d-e 图显示cGAS主要通过其213-522段氨基酸与cGAS相互作用。f图显示H2AX发生S139A突变后，其与cGAS的结合明显减弱。h 图显示cGAS与S139位点未磷酸化的H2AX相互作用的动力学图，可见基本没有结合，与原文的Fig. 2c 形成鲜明对比。i 图显示shRNA能明显敲低H2AX的表达。j-k 图显示敲低H2AX后能明显抑制cGAS在DNA损伤位点的聚积。
6 cGAS抑制DNA损伤后的同源重组
以上证明了DNA损伤后cGAS被招募入核定位到DNA损伤位点，那么cGAS被招募过去发挥什么作用呢？
作者检测了DNA的两种DSBs修复通路的效率，即同源重组（homologous recombination, HR）和非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）修复，发现过表达cGAS可以显著抑制同源重组，对NHEJ则影响不大；降表达或敲除cGAS能明显增加同源重组，对NHEJ也无明显影响。
因为过表达I-SceI造成的DSBs引起了细胞Ⅰ型IFN的表达轻度增加，考虑到经典的cGAS-cGAMP-STING信号通路，Ⅰ型IFN的增加会不会是由于cGAS引起的？cGAS对同源重组的抑制又会不会是通过Ⅰ型IFN发挥的作用呢？
然而作者过表达cGAS发现其不会引起Ⅰ型IFN的表达增加，加入外源性的IFNβ或IFNβ nAb对同源重组和NHEJ也没有明显影响。这些结果提示cGAS抑制DNA的同源重组并不依赖于Ⅰ型IFN的产生。
那么cGAS是如何抑制DNA的同源重组的呢？
作者发现过表达cGAS对细胞周期分布和细胞增殖并无明显影响，但能够抑制两个关键的同源重组因子RPA2和RAD51被招募到DSBs，因此提示cGAS通过影响DNA的同源重组信号通路，而非使细胞周期停滞来影响DNA的同源重组的。
那么cGAS序列的哪一部分参与抑制DNA的同源重组呢？
作者将cGAS的DNA结合域和酶学功能域突变后，cGAS仍能抑制DNA的同源重组，提示这两个结构域非必需；作者诱导cGAS发生Y215E突变或△NLS2突变或用导入蛋白的抑制剂importazole处理后，能明显解除cGAS对同源重组的抑制，说明cGAS的核转位是抑制DNA同源重组的必要条件。此外敲低BLK能更明显地抑制同源重组，掩盖过cGAS对同源重组的抑制作用。
以上证明BLK调控的cGAS核转位过程通过影响DNA的同源重组参与DNA损伤后的修复过程。
本图为原文Fig. 2e-p。e-f 图分别 显示过表达和敲低cGAS可影响HR，而对NHEJ无明显影响。g 图是rescue 实验，在敲除cGAS的细胞中转染cGAS，能明显抑制敲除cGAS引起的HR的增加。h-i 图显示加入IFNβ或IFNβ nAb不影响HR效率。j 图显示DNA辐射损伤后RAD51的动态变化，k 图为其相应的定量，可以看到过表达cGAS明显降低RAD51阳性细胞的数量。l 图为彗星实验，彗星尾巴越长，代表DNA越不稳定，可以看到过表达cGAS降低DNA的稳定性，m 图为其相应定量。n 图显示过表达cGAS组和Y215E突变组都有cGAS的表达，o 图显示Y215E突变能解除cGAS对HR的抑制，p 图显示敲低BLK明显抑制HR效率，且此效应超过过表达cGAS对HR的抑制作用。
a 图显示的是构建DNA双链损伤后HR和NHEJ修复的报告载体的方法。b-c 图显示的是在两位捐赠者的原代细胞中过表达cGAS能明显抑制HR，对NHEJ无明显影响。e 图显示在有或无I-Scel酶时转入cGAS对IFNβ转录的影响。g-l 图显示不同的基因损伤条件下（IR表示离子辐射），cGAS过表达组和对照组的RPA2位点的变化。m-n 图是彗星实验，显示敲除cGAS后基因组DNA的稳定性增强。o-q 图显示在鼠的成纤维细胞细胞中敲除cGAS后，DNA的稳定性增强。r 图显示过表达cGAS对细胞的周期分布无明显影响。s-t图显示的是EdU实验检测细胞增殖。
此图为原文Extended Data Fig. 8。a-g 图为mutation analysis。h图显示加入导入蛋白抑制剂Importazole可以抑制HR，足以掩盖住cGAS的抑制作用。
7 cGAS通过抑制PARP1-Timeless复合物的形成抑制DNA同源重组
通过免疫沉淀及蛋白质谱分析，作者发现DNA损伤后PARP1（poly ADP-ribose polymerase 1）与cGAS存在相互作用。PARP1是一种DNA修复酶，参与DNA的碱基切除修补和DSBs修补。
作者进一步用Co-IP验证PARP1与cGAS确实存在相互作用，且加入DNaseⅠ后这种相互作用仍存在，说明其相互作用不是依赖DNA的。然而加入PARP1的抑制剂奥拉帕尼（olaparib）或将PARP1酶学失活突变（E988K）则能抑制PARP1与cGAS的相互作用。
GST-pull down显示cGAS与PARP1并不存在直接相互作用，GST-pull down、Co-IP和无标记的生物分子相互作用实验显示cGAS与PAR（poly(ADP-ribose)）之间存在直接相互作用。因此PARP1与cGAS的相互作用是通过PAR介导的。
敲低PARP1可以抑制同源重组，并能减轻cGAS对同源重组的抑制。既往研究显示PARP1与Timeless相互作用通过促进同源重组参与DNA的修复，作者发现过表达cGAS能明显抑制DNA损伤后PARP1与Timeless的相互作用，但不影响PARP1被招募到DNA损伤位点。
用奥拉帕尼抑制PARP1的酶学活性几乎能完全阻断DNA损伤后引起的cGAS核转位，提示DNA损伤激活PARP1是cGAS核转位的先决条件。
此图为原文Fig. 3。a 图通过Co-IP证明PARP1与cGAS存在相互作用。b 图为GST pull-down实验结果。c 图显示PAR与cGAS之间存在相互作用。d 图是用表面固定的PAR检测其与不同浓度的cGAS的相互作用，可以看到PAR与cGAS存在相互作用。f 图显示敲低PARP1能明显抑制HR。g 图显示cGAS后抑制PARP1与Timeless的相互作用。
此图为原文Extended Data Fig. 9。a 图为蛋白质谱结果，1和2是过表达cGAS组存在而对照组不存在的两个蛋白条带，b 图显示的是这两个条带代表的蛋白信息。c 图证明PARP1与cGAS存在相互作用，且加入DNase Ⅰ不影响其相互作用。d 图证明cGAS与PARP1存在相互作用，但PARP1的抑制剂Olaparib能减弱其相互作用。e 图显示PARP1的酶学失活突变抑制cGAS与PARP1的相互作用。f-h 图显示基因毒性损伤可引起PARP1与cGAS结合，过表达cGAS则抑制其结合。I-j图显示激光微辐射损伤后PARP1被招募到DNA损伤位点的情况。k-m图显示用Olaparib处理细胞后，再用基因毒性物质刺激，cGAS核转位无明显增加。
8 核内cGAS促进肿瘤发生
作者首先在体内动物模型中发现敲低Cgas可以明显抑制癌症细胞增殖速率和克隆形成，减小肿瘤大小，稳定基因组DNA。
然后作者在临床非小细胞肺癌人群中发现cGAS的异常高表达，及调控cGAS的分子，如KPNA2和BLK的表达水平与非小细胞肺癌患者的预后相关，如KPNA2highBLKlow的患者预后较差。
以上提示cGAS的核转位参与肿瘤的发生发展。
此图为原文Fig. 4。a 图显示shRNA有效敲低Cgas的表达。b 图显示敲低Cgas能明显降低鼠肺癌细胞的增殖速率。c 图显示敲低Cgas可抑制肿瘤集落的形成。d-e 图显示敲低Cgas可明显减小肿瘤的大小。f-g 图显示敲低Cgas可增强DNA的稳定性。h-i 图显示敲低Cgas后肿瘤的γH2AX阳性细胞数量减少，提示DNA损伤减少。
此图为原文Extended Data Fig. 10。a 图为MTT细胞增殖实验结果。b 图显示过表达cGAS可促进肿瘤集落形成。c-d 图分别显示cGAS降表达和过表达条件下细胞在各种基因毒性药物作用下的存活比例（此处学霸觉得似乎弄反了，应该降表达时细胞存活比例增加，过表达时细胞存活比例降低，是我理解错了吗？期待你的指正）。e-f 图显示过表达cGAS促进克隆集落形成。g-h 图显示过表达cGAS降低DNA的稳定性。I图是整篇文章所讲述的故事机制图。j-k 图分别是cGAS在不同时期的肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）中的表达水平。l-m图显示LUAD和LUSC中BLK和KPNA2的表达水平与患者预后的关系。
结论
DNA损伤促进cGAS核转位，通过阻止PARP1与Timeless形成复合物，抑制DNA同源重组，促进肿瘤发生。
学霸总结
看完这篇文章，学霸觉得十分爽快，有种想要击节称赞之感。好的文章就是如此，通过不同的细胞、不同的方法，从临床人群到细胞、再到体内动物，通过正向证明、反向证明，最终证明他的结论，让你不得不信服。
整篇文章讲述这样一个故事：正常情况下，BLK维持cGAS Y215位点的磷酸化，使cGAS定位于细胞质。DNA损伤条件下，cGAS的 Y215位点磷酸化水平降低，cGAS在NLS2序列和导入蛋白的作用下转位到细胞核DNA损伤处，通过PAR与PARP1相互作用，阻止PARP1与Timeless形成复合物，从而抑制DNA的同源重组，降低基因组稳定性，促进肿瘤发生。
本文的套路如下图所示。
希望本文能给你启发。
参考文献
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