实验方法小梳理：NasBS-Seq nasChIP-Seq n

  这是18年发表在science上的一篇工作：Nascent DNA methylome mapping reveals inheritance of hemimethylation at CTCF/cohesin sites

摘要介绍：
  1：表观信息的稳定遗传对于细胞维持基因表达程序和细胞分类特性来说非常重要。
  2：作者在DNA复制后绘制了链特异性DNA甲基化的patten，并显示在20分钟内DNA甲基化情况及一些半甲基化CpG二核苷酸（hemiCpG）复制和遗传情况。

（思考：为什么选择了20分钟的进行半甲基化的观察？它是如何绘制半甲基化的pattern的呢？实验or生信上如何处理？）

  3：通过绘制由三种不同的DNA甲基转移酶（DNMT1 3A/3B）中的每一种靶向的新生DNA甲基化组的图谱，揭示了DNA甲基转移酶与DNA的胞嘧啶之间的相互作用，来促进维持甲基化或半甲基化。

（思考：我们都知道在DNA甲基化的过程中，DNMT酶是非常重要的，主要的DNMT酶有DNMT1,它是重头甲基化的重要酶。接下来是DNMT3A,3B它们是维持DNA甲基化的。但是如何分别绘制这3种不同的pattern呢？）

  4：结果发现了半甲基化的DNA可以去结合CTCF（一种转录结合因子）侧翼的结构域，如果消除半甲基化导致从这些位点发出的染色质相互作用频率降低，表明DNA半甲基化可作为调节CTCF介导的染色质相互作用的并且可作为稳定表观遗传marker。

（思考：它是如何发现半甲基化的DNA可以结合CTCF的呢？有没有什么实验区证明呢？如何证明这个半甲基化的DNA可以当表观遗传的marker呢？）

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带着问题，仔细看看文章。这篇主要是梳理一下method里面的组学实验方法。
NasBS-seq

细胞的起始量10^8

1: 用EdU（50 µM EdU）进行标记。EdU是一种胸腺嘧啶类似物。可以在DNA复制的过程中替代T。37℃20分钟，然后在用DPBS洗2遍，然后加入dT（50 µM dT）进行进一步的细胞培养，37℃8小时。

Ps: 这么做的目的是为了区分父链和子链的标记。保证第一批DNA全部都带上EdU,然后第二个链是为了带上T。带上T的都是子链了

2：交联

用1%的甲醛交联10分钟，然后用0.125M甘氨酸解交联。

用DPBS清洗

3：细胞裂解

Lysis Buffer (5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 10% glycerol)

（用NP-40比较温和的去垢剂是可以很好的裂解细胞膜，对细胞核损伤小，然后后续的话可以利用低速离心的方法把细胞核沉淀下来）

离心下来的沉淀中细胞膜和其他细胞杂质去除较干净，然后加入溶解buffer，溶解沉淀

Sonication Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mMNaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, 0.1% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauroylsarcosine)（后面两种都是去垢剂裂解细胞核）

4：超声打断冰上进行

5：加入终浓度为1%的TritonX-100然后进行 离心 15000g 10min

6：收集上清液为染色质的部分

7：加入Elution Buffer解交联

Elution Buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 1% SDS)和6）中的提取液 1:1 在68℃进行解交联

（缓冲液的体系是为了沉降DNA）

8：加入蛋白酶K至终浓度为0.2mg / ml，然后在55℃温育30分钟

（加入蛋白酶k是为了去掉一些蛋白酶）

9：然后利用苯酚氯仿的方法抽提DNA

10：进行nasBS-seq转化

基础原理用到的是何川实验室开发的新技术hMe-seal这个技术，但是我看文献，这个是针对5hmc的一个作用。但是如何进行BS-seq呢？加上叠氮基进行点刺激把基团加上去，乙醇沉淀DNA

11：利用beads去结合NDA，然后用NEB的盒子进行末端修复，加接头

compare

After washing, beads were incubated with Klenow Fragment (3'→5' exo-) reaction mix (NEB) on a rotator for 30 min at 37 °C. Beads were washed and then incubated with T4 DNA ligase reaction mix (NEB) and methylated adaptors (Illumina) on a rotator for 4 hr at room temperature.

12 洗beads (没说洗beads溶液配方，洗多长时间)

洗涤后，将珠子在150mM NaOH中在室温下温育3分钟。 上清是

收集3作为含有亲本链DNA（生物素 - ）的级分。 将珠子用NaOH洗涤3次，重悬于95％甲酰胺和10mM EDTA pH 8.2中，并在90℃下孵育3分钟。 收集上清液作为含有子链DNA（生物素+）的级分。

13 乙醇沉淀DNA 分别进行甲基化建库。

将两种级分乙醇沉淀，与1μgλDNA混合，并用EZ DNA甲基化 - 闪电试剂盒（Zymo）转化亚硫酸氢盐。 用HiFi尿嘧啶+聚合酶（KAPA）进行PCR扩增。 对于每个文库，使用最小数量的PCR循环产生至少20ng DNA，用AMpure XP珠子（Beckman Coulter）纯化后测量。

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nasChIP-SEQ

使用大约1×10 7 H 9 hESC制备每个nasChIP-seq文库。

前面一步超声打断

将抗CTCF（Millipore）或-SMC1A（Millipore）抗体与Dynabeads蛋白A珠（Thermo Fisher）预温育。（时间没说清楚）

将提取的染色质与抗体 - 珠子复合物在旋转器上于4℃温育5小时。

用洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.1,500mM NaCl，2mM EDTA pH 8.0,1％Triton X-100,0.1％SDS）洗涤珠子一次，用LiCl缓冲液（10mM Tris-HCl pH 8.1）洗涤两次 ，250mM LiCl，1mM EDTA pH 8.0,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠），和1x TE pH 8.0，含50mM NaCl一次。

通过将珠子在洗脱缓冲液中于65℃温育30分钟来洗脱DNA。 交联逆转，蛋白酶K消化，苯酚：氯仿：异戊醇提取，乙醇沉淀，点击化学，乙醇沉淀，链霉抗生物素蛋白珠下拉和Illumina文库制备步骤与上述用于nasBS-seq的相同

nasChIP-BS-SEQ

使用大约3-5x10 7 H 9 hESC制备一对亲本和子链

每种情况下都有nasChIP-BS-seq库。

使用抗DNMT1（Abcam）， - DNMT3A（Abcam）或-DNMT3B（Abcam）抗体。

所有步骤与上述用于nasChIP-seq的步骤相同，不同之处在于如上所述对于nasBS-seq进行与甲基化衔接子的连接，链分离和亚硫酸氢盐转化步骤，以针对每种条件产生一对亲本和子链文库。

ChIP-hairpinBS-SEQ

使用大约3×10 7 H 9 hESC制备每个ChIP-hairpinBS-seqlibrary。 将抗CTCF（Millipore）抗体与Dynabeads蛋白A珠（Thermo Fisher）预温育。 将提取的染色质与抗体 - 珠子复合物在旋转器上于4℃温育5小时。 用洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.1,500mM NaCl，2mM EDTA pH 8.0,1％Triton X-100,0.1％SDS）洗涤珠子一次，用LiCl缓冲液（10mM Tris-HCl pH 8.1）洗涤两次 ，250mM LiCl，1mM EDTA pH 8.0,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠），和1x TE pH 8.0，含50mM NaCl一次。 通过将珠子在洗脱缓冲液中于65℃温育30分钟来洗脱DNA。 进行交联逆转，蛋白酶K消化，苯酚：氯仿：异戊醇提取，乙醇沉淀，末端修复反应和A-尾随反应。其余方案遵循中报道的方法。

REF:
1:https://science.sciencemag.org/content/359/6380/1166
2:http://www.sohu.com/a/160980890_688647
3:https://www.nature.com/articles/srep00095#discussion
4:http://www.sciencemag.org/content/359/6380/1166/suppl/DC1?_ga=2.90622042.1706319630.1556038148-672728011.1546053502