流式笔记 2019.5.16

实验准备

1. 细胞染色

荧光基团选择需要考虑发射光的波谱和强度：
当染色数少时，尽量选择发射光波长间隔较宽的荧光，减少补偿
表达量低用强光，表达量高用弱光
除DAPI外，需要染半小时（DAPI在上机前染5s即可）

2. 检查鞘液（双蒸水）、废液

3. 开机流程

4. 设置通道

将实验中需要用到的通道打开，输入荧光对应的marker

上机实验

1. blank

图A.    X轴：FSC-A    Y轴：SSC-A    去碎片、去肿胀细胞，gate活细胞（死细胞自发光会造成假阳性）
图B.    X轴：FSC-H    Y轴：FSC-W    去黏连，gate单细胞（黏连细胞会造成假阳性）

注意点： 细胞上机前需要滤膜过滤，防止堵塞机器
        每一次gate都要建立在父群的基础上
        点击右键、属性，X轴选择符合样本，使样本点位于视图中间合适位置
        
原理：   FSC：Forward scatter，表征细胞大小    
        SSC：Side scatter，表征细胞复杂程度
        FSC小、位于左侧的一群为细胞碎片，活细胞中淋巴细胞FSC、SSC较小，粒细胞SSC较大

2. 单标管（以三色为例） 调补偿

例：
    单标管1
        图C.D.E.    X轴分别为荧光1-3    Y轴分别为SSC-A、荧光1、荧光1
    单标管2
        图C.D.E.    X轴分别为荧光1-3    Y轴分别为荧光2、SSC-A、荧光2
    单标管3
        图C.D.E.    X轴分别为荧光1-3    Y轴分别为荧光3、荧光3、SSC-A

补偿：波谱靠近的通道会相互影响    
调补偿：将单标管的阴性群与阳性群调至同一竖直线，使X轴方向不存在阳性
调补偿矩阵：   选择纵坐标-横坐标项，增大其数值

小技巧：    可以选阴性群和阳性群大约各50%的marker，偶联实验所需的各种荧光基团制成单标管，调补偿时更方便
注意：      运行后略做调整，及时开始记录  
           每次点击“下一个试管”后，将试管命名为marker-荧光

3. 实验管

染DAPI（1000x，一般加0.5ul），滤膜过滤，上机
运行，略做调整后记录，圈门（图F.G.H等等，根据需要)，之后每支样品管只要记录即可。

4. 结束实验

保存数据，清洗，关机，检查废液、鞘液，登记