国自然热点m6A实验, 竟然只需五步!
随着m6A甲基化的发现和测序技术的发展，关于m6A的研究文章在各大高分杂志层出不穷，与此同时，m6A的研究也慢慢的进入精细化研究，这就出现了一个问题，下一步，m6A的研究应该如何开展。近日一篇由Hui Han等人发表在Molecular Therapy: Nucleic Acid（IF：8.886）上的文章：“ METTL3 mediated m6A mRNA modification promotes esophageal cancer initiation and progression via Notch signaling pathway ” 揭示了METTL3介导的m6A修饰在促进ESCC启动和进展中的关键功能。生信人
研究背景和待解决的问题
食管癌是一种致死性恶性肿瘤，死亡率高，食管鳞癌占食管癌的90%以上，异常的基因改变和/或表观遗传学异常常导致食管鳞癌（ESCC）的发病机制。此外，错误调控的DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA也会导致错误调控的基因表达和促进ESCC的发展。先前的研究表明，m6A甲基转移酶METTL3可增强多种癌基因的表达，从而促进癌症的进展。但METTL3介导的m6A修饰的生理功能及其在食管鳞癌（ESCC）中潜在分子机制仍不清楚。
因此本文要解决的问题是METTL3介导的m6A修饰是否参与了ESCC肿瘤产生与进展的过程，如果有，那么m6A在ESCC调节中的下游靶点和潜在分子机制是什么？
结果
一、食管鳞癌中METTL3升高，与ESCC预后不良相关
为了研究METTL3介导的m6A修饰在食管癌中的潜在功能，研究人员使用TCGA数据库测定了METTL3在食管癌患者样本中的表达。结果表明：
1、与正常组织相比，食管肿瘤组织中的METTL3 mRNA表达显著上调；
2、METTL3的高表达与晚期肿瘤分级和癌症分期以及食管癌的高淋巴结转移活性相关。
3、METTL3表达较高的患者无病生存状态明显较差。
4、对食管癌患者队列中的肿瘤组织进行了METTL3免疫组织化学（IHC）染色结果发现，ESCC肿瘤组织中METTL3的表达明显高于肿瘤周围组织。
结果表明，m6A甲基转移酶METTL3在ESCC中显著上调，并与ESCC预后不良相关。
图 1：METTL3 在 ESCC 中升高，是 ESCC 患者的阴性预后因素
二、靶向 METTL3 表达会损害 ESCC 进展
上述 METTL3过表达对ESCC预后不良影响的结果非常显著，因此研究人员希望进一步研究METTL3调节ESCC的潜在分子机制。
研究人员使用shRNA1和shRNA21均显著降低METTL3蛋白表达，而METTL3的敲除抑制ESCC细胞的增殖和部落形成。其次研究人员进行伤口愈合试验和迁移试验，进一步发现METTL3缺失显著减少了ESCC细胞的迁移。此外，细胞侵袭试验表明，METTL3的敲除降低了TE-9和TE-10细胞的侵袭能力。
以上体外结果揭示了METTL3的缺失导致体外和体内ESCC的生长和进展降低。
图2：靶向METTL3的表达损害了ESCC在体外的进展
三、METTL3介导的m6A修饰调节Notch信号通路
既然确认 m6A在ESCC进展调节中的关键作用，因此下一步就是确定m6A在ESCC调节中的下游靶点和潜在分子机制。作者使用 meRIP-seq 实验及进行了RNA-seq数据的基因本体分析，对 ESCC细胞中 RNA 的 m6A 修饰状况进行了研究。结果表明METTL3在ESCC细胞中调节Notch通路的潜在功能，此外，基因集富集分析（GSEA）发现ESCC细胞中METTL3的缺失导致Notch信号通路基因表达的显著变化。
Notch信号通路是癌症中重要的致癌通路，因此研究人员进一步研究了METTL3介导的m6A mRNA修饰在ESCC中Notch通路调控中的作用。表达分析显示，与对照组相比，ESCC样本中NOTCH1表达显著上调。此外，METTL3和NOTCH1的表达显著相关，接下来在敲除了METTL3的表达后，研究人员发现METTL3的缺失导致NOTCH1的m6A修饰水平、mRNA和蛋白质表达水平降低。生信人
上述结果均揭示METTL3调节ESCC细胞中m6A修饰和NOTCH1受体的表达。
图3：METTL3介导的m6A修饰调节Notch信号通路
四、Notch通路的激活拯救了METTL3缺失的ESCC细胞中的ESCC进展
为了确定Notch信号通路是否是ESCC中METTL3的关键下游靶点，研究人员进一步通过强制激活METTL3缺失细胞中的NOTCH1进行拯救试验。结果表明，NOTCH1信号通路的强制激活挽救了METTL3敲除ESCC细胞的生长和集落形成能力。此外，伤口愈合、迁移和侵袭分析进一步显示，NOTCH1激活显著促进METTL3缺失的ESCC细胞的迁移和侵袭。
机制上，研究人员发现NOTCH1信号通路是促进METTL3在ESCC进展中功能的关键m6A靶点，因此靶向Notch通路是治疗ESCC的一种有前途的治疗策略。
图4：Notch通路的激活挽救了METTL3缺失细胞中的ESCC进展
五、Mettl3的敲除抑制体内ESCC起始
为了确定Mettl3在ESCC启动调节中的作用，研究人员首先通过三苯氧胺注射诱导Mettl3敲除，然后使Mettl3 cKO和对照小鼠接受16周4NQO治疗以诱导ESCC形成。第21周，处死小鼠，分析Mettl3 cKO和对照小鼠的ESCC肿瘤发生。
结果表明：
1、与对照组小鼠相比，Mettl3基因敲除导致cKO小鼠食管中的病变更少且更小。
2、苏木精-伊红染色（H&E）显示Mettl3 cKO小鼠比对照小鼠的发育不良和鳞状细胞癌数量显著减少。
3、IHC染色进一步发现，来自Mettl3 cKO小鼠的ESCC中Ki67、NOTCH1和HES1表达水平显著降低。生信人
这些结果表明Mettl3基因敲除降低了NOTCH1信号通路活性，并减少了ESCC在体内的增殖。
图5：Mettl3的敲除抑制体内ESCC的发生
六、Mettl3对体内ESCC进程至关重要
研究人员利用Mettl3基因敲除和敲除小鼠模型建立了体内ESCC肿瘤模型，用Mettl3 cKO小鼠确定Mettl3在ESCC进展中的作用。步骤如下：
首先，处理角蛋白14 CreER；Mettl3fl/fl和对照组小鼠用4NQO诱导ESCC形成16周。
之后，向所有具有相同荷瘤条件的小鼠注射三苯氧胺，以在cKO小鼠中诱导Mettl3敲除。
最后在第21周，处死小鼠，以分析Mettl3在体内ESCC进展中的功能。
结果表明：
1、与对照组小鼠相比，荷瘤小鼠的Mettl3基因敲除导致进展缓慢，肿瘤症状减轻，cKO小鼠可见病变面积减少。
2、在已存在ESCC的小鼠中，Mettl3基因敲除可显著减少发育不良和鳞状细胞癌的数量。生信人
3，Mettl3基因敲除还导致ESCC中Ki67表达和NOTCH1信号通路活性降低，表明Mettl3对ESCC在体内的NOTCH1激活和增殖活性至关重要。
图6：Mettl3的敲除抑制体内ESCC进程
七、METTL3过表达促进Mettl3转基因小鼠体内外ESCC肿瘤发生
鉴于METTL3在人类ESCC样本中的表达显著上调，研究人员确定METTL3的过度表达是否可以促进ESCC的进展。数据显示METTL3的过度表达促进了ESCC细胞中NOTCH1的表达，功能上，METTL3过表达促进ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成能力，进一步支持METTL3-m6A-NOTCH1轴在ESCC进展调节中的基本功能。
图7：METTL3的过表达促进体外ESCC进程
研究人员进一步建立了Mettl3条件敲除（cKI）小鼠模型，以研究Mettl3在ESCC体内肿瘤发生中的作用。实验步骤如下：
1、将角蛋白14-cre小鼠与Mettl3ki/wt小鼠杂交，以产生Mettl3小鼠模型。
2、用4-硝基喹啉N-氧化物（4NQO）治疗Mettl3 cKI和对照小鼠16周，以诱导ESCC肿瘤发生。
3、第20周，处死小鼠，研究Mettl3过度表达在ESCC体内肿瘤发生中的作用。
结果表明：
1、与对照组小鼠相比，Mettl3 cKI小鼠可见病变区域显示的肿瘤负荷显著增加。
2、苏木精-伊红（H&E）染色显示，与对照组小鼠相比，cKI小鼠异型增生和鳞状细胞癌的数量显著增加，这表明强制表达Mettl3导致ESCC的肿瘤发生率增加。
3、IHC染色发现cKI小鼠中Mettl3和Ki67水平显著上调，表明cKI小鼠的肿瘤更具侵袭性。
4、METTL3 cKI小鼠中NOTCH1 HES1和SOX2的表达显著上调，证实METTL3在体内激活ESCC中的NOTCH1信号通路。
图8：METTL3的敲除促进体内ESCC肿瘤的发生
讨论
先总结一下这篇文章的思路：
1.使用TCGA数据库测定了METTL3介导的m6A修饰在食管癌患者样本中的表达。
2. 使用两种不同的RNA（shRNA1和shRNA2）研究METTL3调节ESCC的潜在分子机制， 体外结果揭示了METTL3在ESCC进展调节中的关键作用。
3. MeRIP-Seq 鉴定m6A在ESCC调节中的下游靶点和潜在分子机制，聚焦到 Notch上；
4. METTL3介导的m6A修饰在ESCC中调节Notch信号通路的潜在作用进行验证；
5. 对 Mettl3在体内调节ESCC启动和进展的功能进行研究
总的来说，研究人员采用了强有力的体外和体内证据支持METTL3介导的m6A修饰在促进ESCC启动和进展中的关键功能。本文整套实验下来从大到小逐级深入，不失为一个研究m6A修饰的教科书级别思路，建议收藏借鉴。
