单测揭示川崎病治疗前后免疫组成变化
前言
Immugent今天给大家解读一篇去年发表在Nature Communications的文章，题目为：Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients的文章。文中对急性川崎病(Kawasaki disease，KD)患者治疗前后的外周血单个核细胞进行单细胞转录组测序，发现单核细胞是促炎介质的主要来源，可能是PBMC的治疗靶点。并且作者揭示了治疗前后B/T细胞的比例变化，并对克隆扩增情况进行了具体分析，为KD的发病机制和治疗提供新见解。
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至于为啥要选这篇文章进解读呢？理由有以下几点：1.这篇文章思路简单，主题是某种药物治疗前后的单细胞图谱变化，大家可以抄作业；2.文章分析过程很简单明了，而且数据都已经上传，相关领域的小伙伴可以使用它的数据；3.文章设计非常适用于罕见病的套路，大家可以参考这篇文章用于自己研究的罕见病中。
好啦，废话不多说了，下面开始解读~~
主要内容
研究背景
川崎病(KD)是一种可导致冠状动脉病变(CALs)的儿童期急性、全身性发热性疾病和血管炎。这种疾病主要影响5岁以下的儿童，已成为许多发达国家儿童获得性心脏病的最常见原因。KD的病因仍不明确，诊断仍取决于主要的临床特征，包括发热、皮疹、结膜炎、口腔黏膜和四肢变化以及颈部淋巴结病变。由于KD的体征和症状类似于其他儿童发热性疾病，及时诊断KD仍然具有挑战性。发热后前10天内给予大剂量静脉注射免疫球蛋白(IVIG)是KD的标准治疗，可显著降低CAL率。但IVIG治疗KD的机制尚不清楚。大约10%-20%的KD患者对IVIG耐药，发生CAL的风险增加。最近，在严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)流行期间报道了一种新的儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。尽管MIS-C和KD之间具有不同的流行病学和临床特征，但两种疾病均存在持续发热和常见的皮肤粘膜表现。因此，在研究调查中迫切需要区分MIS-C和KD。
全基因组关联研究(GWAS)已确定了一些有关KD的易感基因，包括ITPKC、CASP3、FCGR2A、CD40、MHCⅡ类在内的许多易感基因与免疫功能有关。尽管如此，50多年来，引发疾病的病原体仍存在广泛争议。各种病原体已被提出作为触发因素包括超抗原毒素、EB病毒、冠状病毒和逆转录病毒，但均未得到后续研究的证实。尽管病因尚不确定，但免疫系统的激活为其发病机制提供了重要证据。KD急性期血浆促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ水平升高。包括中性粒细胞和单核细胞在内的固有免疫细胞在外周血中升高，并在疾病早期在动脉壁中发现。外周血淋巴细胞的激活似乎也是KD发生的原因，尽管它们的作用仍存在争议。此外，抗原特异性IgA浆细胞和CD8 + T细胞浸润炎症组织，意味着对通过呼吸道进入的细胞内病原体的免疫应答。
研究结果
结果（一）：研究人员收集了7例急性KD患者来源的14份新鲜外周血标本（P1-P7），对于每例患者，在IVIG治疗前发热发作后第5天采集首次血样。第2份样本在完成IVIG治疗和退热后24 h获得。然后使用10×Genomics平台对从样本中分离的PBMC进行scRNA-seq。通过QC的检测细胞总数为84986个，其中IVIG治疗前患者的34073个细胞，治疗后的36225个细胞，健康对照的14688个细胞。作者还基于scRNA-seq文库进行了单细胞B细胞受体测序(scBCR-seq)和单细胞T细胞受体测序(scTCR-seq)。
作者使用Seurat进行细胞聚类分析，并使用SingleR进行细胞注释，发现scRNA-seq可以很好地捕获组成PBMC的主要细胞类型，包括T细胞(CD3D、CD3E、CD3G，60.00%)、CD4 + T细胞(CD4，36.94%)、CD8 + T细胞(CD8A、CD8B，18.53%)、自然杀伤(NK)细胞（NCAM1或CD56、KLRB1、NKG7，5.44%）、B细胞（CD19、MS4A1或CD20、CD38，22.27%）、单核细胞（CD14、CD68, FCGR3A或CD16，9.60%）、髓样树突状细胞(mDC)(CD1C，0.26%)、浆细胞样树突状细胞(pDC)(LILRA4，0.18%)和造血干祖细胞(HSPCs)(CD34，0.12%)。与健康对照组相比，治疗前KD患者显示单核细胞和B细胞百分比增加，而T细胞和NK细胞百分比降低。
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结果（二）：作者在个体水平上比较了IVIG治疗前后KD患者以及健康对照者每种免疫细胞类型的百分比（图2a）。scRNA-seq数据表明，与治疗后相比，治疗前KD患者的B细胞百分比增加（P = 0.02），CD4 + T细胞百分比降低（P = 0.01）（图2a）。此外，与健康对照组相比，KD患者治疗前B细胞百分比显著增加，治疗后迅速恢复正常（图2b）。scRNA-seq数据也显示KD患者CD8 + T细胞百分比低于健康对照组，这也与之前的报告和流式细胞术结果一致。在急性KD中有报道NK细胞减少，在单细胞数据中可以观察到NK细胞相似的趋势，但由于scRNA-seq的样本量较小，缺乏统计学显著性（图2a）。
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结果（三）：然后作者开始解析每种细胞类型的异质性。IVIG治疗后，患者的CD16 + 单核细胞百分比显著降低，未发现治疗前KD患者与健康对照组之间存在显著差异（图3a）。在所有PBMC群体中，最多的DEG(FDR < 0.05)来自单核细胞，通过GO分析发现它们显著富集了S100蛋白、免疫球蛋白受体、细胞因子受体、补体和受体以及MHC II类受体（FDR < 0.05，图3b）。S100A8、S100A9和S100A12主要由中性粒细胞和单核细胞表达，它们在一系列疾病中发挥促炎功能。与治疗后和健康对照相比，这些基因在治疗前显著过表达（图3b）。同样，大多数编码免疫球蛋白受体的DEG在治疗前KD患者中过表达，包括FCGR3A、FCGR3B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR1B和FCEG1G（图3b）。作者发现大多数补体和受体的DEG在治疗前上调，包括C1QA、C1QB、C1QC、C2、CFD、C3AR1和C5AR1（图3b）。相反，与健康对照组相比，无论接受何种治疗，KD患者中编码MHC II类受体的大多数DEG均下调，包括HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB和HLA-DOA（图3b）。编码细胞因子和趋化因子受体的DEGs的表达模式更多样。虽然其中一些在治疗前患者中过表达，包括IFNAR2、IFNGR2、IL3RA、IL10RB和CX3CR1，但其他一些在治疗后患者或健康对照中过表达，包括IL7R、IL13RA1、IL6ST和CXCR3（图3b）。
由于高细胞因子血症是KD最重要的特征之一，因此作者对细胞因子进行研究发现，IL1B和TNF主要在PBMC的单核细胞中表达，并在治疗前KD患者中上调（图3d）。除S100基因外，单核细胞也是表达CCL2、CXCL10、CXCL8、HGF、IL15、IL18、RETN和TNFRSF1B的主要来源（图3c）。尽管并非所有这些都可以在不同条件下检测为DEGs，但随着单核细胞丰度的增加，预期治疗前KD患者中细胞因子的总量会升高。
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结果（四）：在不同的B细胞亚群中，包括幼稚B细胞(MS4A1、TCL1A，62.73%)、记忆B细胞(MS4A1、CD27、IGHA1、IGHG1，17.27%)、浆细胞(CD27、CD38、IGHA1、IGHG1，6.24%)和介于幼稚细胞和记忆细胞之间的细胞(13.77%)。IVIG治疗后，总B细胞中浆细胞比例较治疗前增加。
尽管B细胞在所有PBMC细胞群中的DEGs最少，但DEGs富集在几个有趣的功能类别中，包括细胞周期过程、干扰素信号通路和S100基因（图4c）。与治疗后患者相比，治疗前KD患者中许多与细胞周期正相关的DEGs上调，如CCND2、RRM2、CENPM、NME1、CKS1B和MYC，而治疗前患者中抑制细胞周期的DEGs下调，如BTG2和CDKN1B（图4c）。这些表达模式与治疗前B细胞丰度显著增加一致。治疗后多个干扰素应答基因上调，包括IRF1、STAT1、ITGB7、PARP14和CD38（浆细胞表达的细胞活化标志物）（图4c）。与健康对照组相比，KD患者中S100A8、S100A9和S100A12的表达较高，但治疗前后未发现显著性（图4c）。
IVIG治疗后，IGHA和IGHG的百分比显著升高，表明B细胞活化导致免疫球蛋白从IgM/IgD转换为IgG/IgA的同种型转换。除P7外，大多数患者治疗后克隆性BCR（clonal size ≥3）的百分比与治疗前相比显著增加（图4e）。基尼系数测定的BCRs克隆性在治疗后KD患者中也显著高于治疗前患者和健康对照组。值得注意的是，除P7外，在每例治疗后患者中，我们均可观察到显著的寡克隆扩增，其主要为IgA和IgG同种型。
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结果（五）：CD4 + T和CD8 + T细胞均由三个亚群组成（图1）：幼稚细胞(CCR7，SELL，70.41%)、中央记忆细胞（CCR7，SELL和S100A4共表达，12.04%）和效应记忆细胞(S100A4，6.54%)。记忆CD8 + T细胞也表达高水平的细胞毒性相关基因(GZMK、GZMB)。此外，还发现了调节性CD4 + T细胞(FOXP3，3.51%)、γδT细胞(TRDC，5.34%)和增殖T细胞(TYMS，2.15%)。虽然没有观察到急性KD期间CD4 + T细胞亚群的显著变化（补充图16），但作者发现幼稚细胞百分比显著增加。与健康对照组相比，KD患者CD8 + t细胞中效应记忆细胞百分比降低，表明效应记忆细胞是PBMC中CD8 + T细胞减少的主要亚群。NK细胞包括两个亚群，CD16-高细胞(FCGR3A，89.83%)和CD56-高细胞(NCAM1，KLRC1，10.17%)。治疗后CD16高NK细胞百分比降低，与CD16 + 单核细胞的趋势相似。
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CD4 + 和CD8 + T细胞中的许多DEG具有与免疫应答和能量代谢相关的相似表达模式。虽然其中一些DEGs在治疗前如IFNGR2、ITITM2和SOCS3上调，但其他DEGs在治疗后上调，如STAT1、IRF1、GBP1、GBP4和IL10RA。与B细胞相似，KD患者所有这些淋巴细胞群中S100基因的表达均高于健康对照组（图5c）。此外，基因集富集分析确定了CD4 + 和CD8 + T细胞中几个标志性基因集的显著协调变化（图5d），相对于治疗后患者和健康对照，治疗前患者中氧化磷酸化和MYC靶标被强烈激活。
根据scTCR-seq数据，发现具有克隆性TCR（clonal size≥3）的T细胞富集了高表达GZMB的效应记忆CD8 + T细胞，表明细胞具有较强的细胞溶解活性。
展望
在这项工作中，作者以单细胞分辨率对急性KD以及治疗缓解后的患者外周血单个核细胞进行了分析。发现单核细胞是促炎介质的主要来源，可能是PBMC的治疗靶点。浆细胞和效应记忆CD8 + T细胞也参与KD的发病过程，而在IVIG治疗后B细胞受体(BCRs)和T细胞受体(TCRs)寡克隆扩增，研究结果显示了和KD发病机制相关免疫细胞群的功能变化，和治疗中每种细胞类型特有的整体和动态免疫反应。
好啦，本次分享到这就结束啦，我们下期再会~~
[参考文献]
Wang, Z., Xie, L., Ding, G. et al. Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients. Nat Commun 12, 5444 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25771-5
