RNA-seqRNA Seq流程rna-seq

转录组那些事儿 Part I

2018-08-19  本文已影响38人  刘小泽

刘小泽写于18.8.19
之前写过三次关于转录组的实战小文,但是说实话,的确当时还不理解其中的含义,只是想跑个流程,更别说脚本优化了。就像刚买来一部心仪的电子产品,只想着拆开包装,嗅一下新机的味道,看看做工怎样,手感如何,但是它的内涵却不曾理解。后来学了其他的组学,接触久了,发现不深入了解,自己是无论如何都发掘不了它的潜力。

转录组火起来的原因主要是它能结合高通量测序,快速准确地识别转录本,进行表达定量,当然这也是它的核心功能。一般常见的转录组分析是找差异基因、协同变化基因、标记基因、融合基因、新转录本、可变剪切。结合R语言进行可视化、功能注释、网络分析。它既可以单枪匹马,也可以为别的组学打辅助。

好的结果离不开设计

差异来源?

能干什么?

  1. 比较mRNA水平
    • 同物种同组织不同处理:研究不同条件下基因的表达差异
    • 同物种异组织:不同组织中基因的表达差异
    • 同组织异物种:基因进化上的关系
    • 以上三种可以加上时间变化:研究不同发育/用药时期基因表达差异
  2. 基因互作:大量样本建立基因的网络关系,找出通路,发现功能
  3. 表达模式:大量样本进行分类,发现与性状相关的基因,对样本进行预测

要测什么?

怎么提取?

原核生物大部分是核糖体RNA(rRNA),它的mRNA只占据了1-5%。要测它的mRNA,需要先提取纯化。

检测是否合格的指标:RNA总量、RIN值、OD260/280以及真核28S/18S、原核23S/16S。RIN值越高,28S/18S越接近2表示提取的RNA完整性越好。RIN值高于6.5可以做建库准备,太低影响准确度。有一些昆虫或者水生动物没有28S条带,因此RIN值不能作为参考,但是18S的前基线平稳即可

重复、深度、长度?

重复

一般生物学重复要保持3以上,另外重复之间的Spearman相关系数要大于0.9(遗传背景不一致的相关系数要大于0.8)

另外,日常公司所说的“样本数量”=生物处理数*重复数,比如你有对照和处理组,各有三个重复,那么就是6个样本,当然测序分析的费用也是按样本收取

有一篇文章用酵母做过实验,doi: 10.1261/rna.053959.115,结果发现,随着重复的增加,找到差异基因越多;要筛到90%以上的差异表达基因,需要30个重复;其实实际分析,也不需要这么多的差异基因,使用合适的软件如edgeR或Deseq,可以控制假阳性率,即使样本重复数比较低,筛出的差异基因可信度还是比较高的。两个结论:生物学重复至少6个;对于每个实验处理要找到大部分(大概是80%以上)差异基因,至少12个生物学重复

根据文章https://doi.org/10.1186/s13059-016-0881-8当重复数为3时,差异倍数(Fold Change,FC)为1.5的基因只能找到43%。另外差异倍数较大的(FC>4)一般都能被覆盖到

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深度

指的是测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。深度越大,得到的reads条数越多,碱基越多。鉴定表达量中等深度即可,PE 150的reads数20M,测6G数据

结论就是:要为了找差异,花同样钱,多测样本好过加大深度

长度

多测一些长片段可以提高比对效率和转录本识别率,意思就是目标越大越易寻找,尤其对于基因组注释不好或者没有参考基因组的物种,双端测序加上长reads,会增加结果准确性

批次效应?

也许你见过它的分身"batch effect"。它是怎么回事呢?

不同测序平台的数据,同一个平台不同时间或者不同lane上产生的数据,同一样本不同时期,不同试剂做的同一样本等等,这些条件下产生的数据都是批次效应。简单说,就是你的数据量比较大时就容易出现。

是什么?

最常见的就是公司给你测的时候,不是放在一个测序仪上,对照组和实验组分开放置,比如对照是敏感组,实验组是抗性组,先测了抗性组,后来才测了敏感组,结果确实分析出了许多的差异基因。但差异基因是准的吗?会不会有可能是由于敏感组后来测的时候又发生了一些变化呢?说不准,但的确这里上机测序的时间成了干扰因素。要减少批次效应,一大方案就是选择支持更多样本的测序仪,例如NovaSeq一次建库就能容纳96*4个样本

尤其在分析公共数据库时,整合多个不同测序平台数据一起分析差异,这时很容易引入批次效应

如何检测?

怀疑哪个因素产生了干扰,就把它标记出来,比如怀疑时间产生了影响;然后对差异基因聚类分析,看看与时间前后是否相关,若相关就存在批次效应

如何校正?

详细内容可以看这本书https://genomicsclass.github.io/book/第10章

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分析模式

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好的结果离不开分析

一、数据预处理

二、比对

虽然双端测序一次测了头和尾,但是并不能将整个mRNA转录本覆盖。我们结果得到了几百万条reads,要是知道哪条reads来自哪个转录本就能有的放矢,下面计算reads表达量也就知道了某个转录本或者基因的表达量。
将测序reads与参考转录本/基因的比较匹配过程就是比对,可以说mapping 或者alignment

由于DNA转录得到mRNA时将内含子切除,因此mRNA反转录得到的cDNA不一定十分完美的还原回原基因组,相当大一部分会被分开。因此原来为基因组比对设计的软件如bwa可能效果会下降,可以采用专门为转录组开发的比对软件Hisat2、STAR,可以找到剪切位点。当然,如果只为了寻找差异基因,可以用bowtie2以及更快的非比对软件salmon、sailfish、jellyfish

文章A survey of best practices for RNA-seq data analysis中做了几款主流的比对软件Tophat、Hisat2、STAR评测,结果发现:

看似简单的比对过程,就是帮150bp的reads找到家,其中可能还要让reads付出点“被分割”的代价。但是, 基因组有多大?人类的是3G,也就是30亿碱基,一个150bp对于整个基因组来说,简直不值一提,要从头一个一个比对吗?姑且这样可以,那么我们有多少reads?一般6G数据,150PE,会有20Mreads(=60亿/150/2),也就是2000万条reads。这该怎么办?怎样保证高效和低错误率?

reads是测序仪决定的,是固定的,就是这么多,就是这么长。那么我们只能从参考基因组入手,怎么让他找的快?这里就用到了一个算法——BWT(Burrows–Wheeler_transform),他其实是一个压缩技术,将原来文本转换成一个相似的文本,转换后让相同的字符位置连续【https://blog.csdn.net/luanzheng_365/article/details/78575429】 。使用这个算法,将基因组变成了一个索引index,而我们要查找的序列就是索引中的一个子集,这样比对的任务就不再是将reads从头到尾和基因组去比较,而是转换成了把子集reads和索引index去比较,做到了有的放矢。

比对完我们需要的是bam文件,然后使用bam还可以做其他一些比对统计,或者导入IGV查看

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三、定量(三个水平)

明天第二部分是用R语言进行下游的特别分析,包括可视化、差异基因筛选、富集分析等,另外还有实战脚本奉上


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