1. 热身（案例及实验设计）

什么是BSA-seq

• BSA（Bulked Sergeant Analysis），即分离体分组混合分析法，也称为集群分离分析法或混合分组分析法，是从近等基因系分析法演变而来的。近等基因系（NIL）指一组遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的株系。BSA法克服了许多作物没有或难以创建NIL的限制，其原理是从一个分离群体中选择目标性状表型极端的10～20个单株，混合构建2个DNA“池”，这两个池应在感兴趣的性状方面存在差异，除了感兴趣基因所在的位点外，所有的位点均随机化。换句话说，两个DNA池间的差异相当于两近等基因系基因组之间的差异，仅在目标区域不同，而整个遗传背景是相同的。对两个池筛选标记，多态性标记可能表示与感兴趣的某个基因或QTL连锁。在检测两个DNA池之间的多态性时，通常应以双亲的DNA作对照，以利于对实验结果的正确分析和判断。
• BSA-seq相比于传统的凝胶电泳技术，实现了标记开发与基因分型的整合，同时能够低成本且快速的完成基因的初定位工作。
• 根据研究表型或群体类型的不同，BSA-seq可分为：MutMap、QTL-seq。

• 根据技术的不同，BSA-seq可分为基于重测序的BSA；基于转录组的BSA（BSR）；基于简化基因组测序的BSA（GBS-BSA）

  
  BSA-seq原理

BSA-seq方案设计

1. 群体选择

• 常见的分离群体包括F2代群体、回交群体（BC）、重组自交系（RIL）、双单倍体（DH）等均可以被用来进行BSA性状定位。
• 目前文献报道的多为F2分离群体（因为构建速度快）。

2. 性状选择

• 常规BSA-seq主要适用于质量性状单基因或数量性状主效基因的定位；
• 数量性状选择极端个体时，不要超过表型范围的15%；
• 如果表型鉴定可能存在假阳性，尽量控制在10%以内；如果无法控制，可选择构建单个混池测序。

3. 混池大小选择

• 单个混池的数量最少10个，否则，定位结果的假阳性会较高；
• 在保障表型准确性的前提下，混池越大，定位区间越小；
• 混池越大，需要的测序深度越高；
• 定位区间还会受到群体类型、基因组大小、候选基因所在区间的影响。

4. 测序方法的选择

• 小基因组物种，建议使用重测序，成本类似的情况下，获得更多变异类型。
• 无参考基因组的物种，建议使用简化基因组或转录组。

• 大基因组且有参考基因组，建议使用转录组。

  
  测序方法选择

5. 亲本测序选择
是否需要进行亲本测序？

• 使用参考基因组品系来源突变体研究时，可不测序亲本；其他情况建议进行亲本测序。

目的：

1. 过滤亲本杂合SNP位点，提高定位结果的准确性；
2. 利用亲本来源的SNP位点，可以避免假阳性结果。