what！又是肿瘤微环境，还11分！！
今天跟大家分享的是发表在nature communications杂志上的一篇文章，影响因子11.878
An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment
由独特的肿瘤免疫微环境定义的独立的预后不良的乳腺癌亚型
首先我们来看一下这篇文章的研究背景，目前尚不清楚免疫细胞混合物如何与癌细胞表型相关联并影响发病机理的。因此在这里作者描述了免疫簇，可提高乳腺癌免疫状况的预后准确性并且在乳腺癌中发现了新的独立预后因素，其突显了肿瘤表型与免疫状况之间的相关性。
结果展示
1.乳腺癌中的免疫簇
作者应用两个平台对95个肿瘤样本中的760个基因的表达进行了测量，首先使用Pearson和Spearman相关性比较了在两个平台上获得的表达，发现基因表达值之间存在高度正相关。接下来为了根据患者在免疫相关基因表达上的相似性对患者进行分组，对相关矩阵进行了无监督分级聚类将患者分为了三个簇。接下来就对这三类患者进行继续分析。
为了确认簇与肿瘤免疫微环境有关（图1b），作者使用了Nanodissect算法对淋巴细胞和骨髓细胞的总浸润进行评分。Nanodissect评分首先根据H＆E切片的免疫浸润评估来验证（图1c）。结果显示这三个簇与淋巴细胞(图1b) 和 骨髓细胞得分显著相关。以上结果表明，簇A-C反应了逐渐的免疫浸润，因此被称为免疫簇。
图1.免疫簇与总免疫浸润有关
2. 簇反映出逐渐的免疫浸润
在这一部分，作者使用来自其他九个队列的表达数据验证了簇与淋巴/髓样浸润之间的关联。结果在以上研究的数据集中找到了760个基因中的509个，应用这509个基因进行无监督聚类（图1d为METABRIC和TCGA队列的聚类）。在每个队列中，获得的三个簇与淋巴样和Nanodissect评分显著相关（图1e）。淋巴和髓样浸润从簇A（低浸润）逐渐增加到簇B（中度浸润）和簇C（高浸润）。为了进一步验证，作者对METABRIC队列26中的免疫浸润进行了病理学评估，这与Nanodissect评分（图1f）和免疫簇显著相关。以上结果表明，使用PanCancer免疫分析阵列的基因进行无监督的分层聚类，可以根据免疫浸润的逐渐水平对乳腺癌肿瘤进行分组。
3. 免疫簇与预后相关
在这一部分作者使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验从生存的角度检查了免疫簇。在METABRIC（n = 1904）和TCGA（n = 981）队列中，发现簇B与预后差有关。当分别对ER阴性病例和ER阳性病例进行分层时，也观察到簇B与预后差有关。为了完善此结果，作者对聚类B与聚类A和C绘制了患者的生存期，并确认了聚类B患者的预后明显较差的结果（图2）。由此得出结论，在ER阴性和ER阳性乳腺癌中，免疫簇均与预后相关。
图2. 免疫簇与预后相关
4. 通过二项式逻辑回归预测免疫簇
在这一部分作者想要开发一种通用方法，该方法可以不依赖于无监督的聚类而准确地预测预后较差组的患者。作者通过对对10个队列（4546个样本）进行训练并对其他5个队列（1555个样本）进行了测试，建立了模型。应用二项式逻辑回归分析获得了一组基因，并进行ROC以及AUC进行评估，从而灵敏地并特异性地预测样本是否为簇B的一部分（图3a）。该模型预测了AUC = 85.8％的免疫簇。通过模型预测方法减少了聚类B的样本数量（图3b）。通过比较生存对数秩检验p值，发现该分类通常改善了免疫簇和生存之间的显著关联。最后作者在另外五个队列中验证了该模型（图3c-e）。
图3.使用二项式Logistic回归预测聚类B
5. 免疫簇，独立的预后因素
在这一部分，作者进一步研究了免疫簇与乳腺癌中的临床病理特征（大小，年龄，等级，分期，淋巴结以及分子亚型（PAM50））之间的关系。簇A富集于ER阳性和Luminal病例中，而在簇C中发现了更高比例的ER阴性和基底样病例（图4a，b）。簇B中ER阴性和ER阳性样本以及PAM50亚型同样显示（图4a，b）。
为了进一步测试免疫簇作为重要的预后生物标志物的强度，作者使用了逐步向后选择。对于所有队列，免疫簇均保持在最合适的最小模型中，在11个队列中的9个中，免疫簇是重要的预后变量（表1）。
表1
6. 在具有复发风险（ROR）分数的新RNA-seq数据集中进行验证
在这一部分，作者应用ROR评分对新的数据集OLSO2-EMIT0进行了评估。结果显示与簇A和C相比，簇B具有中等ROR评分的样本组成（图4c）。这表明与簇B相关的不良预后不能由ROR评分中包含的信息解释。对于所有队列，作者计算了ROR分数证实了簇B由中等的ROR得分组成，如METABRIC队列中所示（图4d）。
图4.免疫簇和临床病理特征
7. 免疫簇和对新辅助化疗的反应
作者使用来自在新辅助环境（手术前进行化学疗法）中治疗的患者的研究的基因表达数据，进一步评估了免疫簇与对新辅助化学疗法的反应之间的关联。该研究的终点是病理完全缓解（pCR），这意味着在手术前的化疗方案结束时完全消灭了癌细胞。我们使用了来自8个研究的基因表达数据（1377个样本），并使用lasso方法为每个样本分配了其免疫簇。结果发现在簇C中的响应者百分比最高（59％），其次是簇A（30％），而群集B中的响应者百分比最低（11％）（图4e）。该结果突出显示了簇B的低响应率，表明此类患者可能是测试新辅助治疗方案的候选人。
8. 免疫簇的剖析
作者使用CIBERSORT算法估计了22种不同免疫细胞类型的比例，对每种免疫细胞类型的中位浸润进行了聚类，并对此类细胞类型特异性中位浸润得分进行了无监督聚类（图5a）。结果显示簇C还富含巨噬细胞M1，记忆激活的T细胞和滤泡性T辅助细胞（图5a），这也由METABRIC和TCGA队列中CIBERSORT得分的分布说明（图5a）。在簇B中，发现了较高水平的巨噬细胞M2，静息肥大细胞和静息记忆T细胞（图5a），还通过METABRIC和TCGA队列的密度图（图5b）进行了说明。使用广义线性模型，作者指定了区分簇B和A，C的免疫细胞类型（图5c）。这些结果表明，簇B中的致瘤性免疫浸润可能有利于肿瘤生长。
图5.免疫簇的剖析
9. 免疫簇的表型分析
为了进一步表征与簇B预后不良相关的表型，作者通过差异基因表达分析鉴定了簇B中明显过量表达的基因。与簇A和C相比，簇B有909个基因上调。GSEA分析显示这些基因与干细胞生物学和EMT相关（图6a）。为了进一步表征免疫簇与癌细胞表型之间的关系，作者使用了与EMT，干细胞，缺氧和增殖相关的来自MsigDB 的11个基因集。使用GSVA方法计算平均基因集富集得分，平均基因集分数的无监督聚类清楚地将免疫簇A和C分开，而簇B分为两个亚组（图6b）。这些结果表明免疫簇和干细胞/ EMT相关基因signature之间的关联。
图6.免疫簇与EMT和增殖相关，这是乳腺癌的两种互斥表型
10. 乳腺癌中两种互斥的表型
为了确定哪些基因集得分解释了簇B，作者使用广义线性模型测试了每个基因集对簇B和簇A和C的贡献。EMT signaturs贡献于簇B，而增殖和细胞运动性与簇A和C相关（图6c）。
11. 肿瘤表型与免疫浸润的相关性
由于免疫簇与免疫细胞类型和基因组特征相关，因此作者正式评估了免疫浸润（CIBERSORT）与癌细胞特征（基因组评分）之间的关系。图6d显示，增殖和EMT得分与不同类型的免疫细胞显著相关。
12. 簇B中基因集评分的异质性
为了探索簇B中的异质性，作者根据基因signature得分以无监督的方式将样本分组为以EMT表型为主的B1和以增殖为主的B2（图6e）。在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的预后较差（图6f）。
好啦，这篇文章的所有内容就这么多啦，总体来说还是很丰富的~
