文献学习015--[sc]心脏原位巨噬细胞抑制纤维化和刺激血管生
这一篇是今年刚刚发表在Circulation Research上的文章，对Sham组和TAC 1w 4w小鼠心脏的免疫细胞做了质谱流式CyTOF，又对Sham和TAC 1w小鼠心脏组织测了CITE-seq，发现组织原位巨噬细胞起了比较重要抑制纤维化和促进血管生成的作用。
此外，去年发表的一篇circulation 单细胞轨迹重建揭示病理性心肌肥厚干预原则对Sham和TAC 2 5 8 11w的小鼠心脏心肌和非心肌进行了单细胞测序，发现了巨噬在TAC 2-5w 心脏从EF正常到异常的过程中起到了重要的调控作用。
此前关于心肌肥厚和心衰的研究主要集中在心肌细胞特异性的通路上。
1. Pressure Overload–Induced Cardiac Remodeling Profoundly Alters the Cardiac Immune Cell Composition
对sham，1w和4wTAC小鼠心脏的测了CyTOF
Fig 1A：质谱流式的结果显示，和sham组相比，1w TAC小鼠心脏CD45+免疫细胞的比例和绝对值都明显增加，而4w TAC小鼠心脏CD45+免疫细胞的比例和绝对值又出现了下降。
Fig 1B：使用ViSNE (Visualized stochastic neighbor embedding) 分析CyTOF的结果，做了细胞群注释。结果提示TAC之后CD64+F4/80+巨噬细胞出现了明显增加。
Fig 1C：作者随后分析了心脏免疫细胞的巨噬marker表达，发现CD11b+CD64+巨噬细胞表达不同水平的CX3CR1, CD206, MHC-II, CCR2和Lyve1。
Fig 1D：随后作者将CD11b+CD64+巨噬细胞圈出，并查看了TIMD4, CX3CR1和CCR2的表达。组织原位巨噬细胞和单核起源的巨噬细胞monocyte-derived macrophages (MoMF)在TAC后1w都出现了增加。然而在TAC后4w时大部分都恢复到了sham水平。
Fig 1E：为了验证Fig 1D的结果，作者换了一种圈门策略。根据CCR2和MHC-II的表达来区分组织原位巨噬和MoMF。同样的，发现TAC 1w后所有巨噬细胞都出现增加，同时CCR2-巨噬增加最为显著。
小结：这些结果提示巨噬细胞尤其是组织原位巨噬细胞在早期肥厚过程中可能起了重要作用。
2. Single-Cell RNA Sequencing Identifies 12 Different Monocyte/Macrophage Clusters
为了更近一步探究心脏巨噬细胞的作用，作者对4只sham小鼠和6只TAC 1w小鼠心脏的免疫细胞进行了CITE-seq（这里用的是droplet-based scRNA-seq）。
Fig 2A：送样流程。是先把每个样本和带有DNA标签的抗体孵育，然后混样（测序前混样，抗体上的DNA标签应该除了抗体的barcode以外还有样品的barcode。）
Fig 2B：测到了60981个细胞，做了质控和barcode去卷积。
Fig 2C：得到33566个带有单一barcode的细胞。其中5854个来自sham组，27712来自TAC组。
Fig 2D：对所有细胞进行降维聚类，得到25个cluster。包括12个单核巨噬群，5个T细胞群，3个B细胞群，1个DC群，1个PMN群和1个NK群。单核巨噬细胞明显占比最高。
Fig 2E：25个群的marker基因热图
Fig 2F：25个群的在Sham和TAC组的比例变化。在数量最多的单核巨噬细胞中，有8个群发生了有意义的比例变化，提示可能发挥了重要作用。
3. Gene Expression Analysis Distinguishes Resident and Monocyte-Derived Macrophages
接下来，作者对12个巨噬细胞群做了更精细的注释（主要是区分了组织原位巨噬细胞和MoMF）。
Fig 3A：首先根据Ccr2和Timd4来区分了TIMD4+CCR2-原位巨噬细胞和CCR2+招募来的巨噬。组织原位巨噬特异性高表达Lyve1, Cd163和 Ccl24，招募来的巨噬高表达抗原呈递基因（MHC-II genes: H2- Aa, H2-Ab1, H2-Eb1, H2-DMa, H2-DMb1, and Cd74），单核细胞高表达Ly6c2和Plac8。
Supplemental Fig 3A：为了更好的比较组织原位巨噬和招募来的巨噬之间的基因表达差异，作者将组织原位巨噬细胞和MoMF单独注释。组织原位巨噬细胞包含1，3，4，11群，MoMF包含0，5，10，14群。
Fig 3B：随后作者比较了组织原位巨噬细胞和MoMF的转录差异，发现组织原位巨噬细胞高表达Lyve1, Cd163, Timd4, Ccl2, 6, 7, 8, 9,24, Mrc1和Lgals1。MoMFs高表达Ccr2, 各种MHC-II genes (H2-DMa, H2-DMb1, H2- Ab), Lgals3, Ccl5, Cxcl10和16, Ifit, Il1b和纤维化调节基因Spp1, Thbs1和Fn1 (fibronectin 1)。
Fig 3C：两类巨噬细胞marker基因的DimPlot
Supplemental Fig 3B：IPA富集分析显示和MoMFs相比，Resident MP富集到了心脏肥厚信号 通路。
Fig 3D：IPA转录因子预测提示和MoMFs相比，Resident MP出现上游regulators IL10RA, IL4, STAT3, IRF2的激活，IFNG, IRF3,IRF7出现抑制。
Supplemental Fig 3C：是对Fig 3D的分cluster分析验证。Fig 3D是把两种细胞的各四个cluster合在一起分析，Supplemental Fig 3C是每个cluster分开分析，提示每个巨噬细胞都有独特的活化方式。
Fig 3E F：前面是组织原位巨噬和MoMF的对比分析，这里作者也做了Sham和TAC巨噬对比的差异基因和转录因子预测。
Fig 3
Supplemental Fig 3
小结： These results highlight key changes that occur within resident macrophages and MoMFs as the heart transitions from an adaptive hypertrophic state towards HF.
4. α-CD115–Mediated Macrophage Depletion Preferentially Affects Resident mφs
为了探究巨噬细胞是否在早期心脏应对压力负荷时出现的获得性肥厚反应中起到重要的作用，作者使用了monoclonal α-CD115 antibody清除了巨噬细胞。
⚠️⚠️⚠️monoclonal α-CD115 antibody可以block CSF-1和表达CD115的细胞结合，引起髓系细胞清除。
Fig 4A：巨噬清除流程图
Fig 4B：作者首先检测了一下清除效率(day 0)。在注射了α-CD115或isotype control antibodies 7天之后(做TAC的时候)，使用流式检测了组织原位巨噬和和MoMF。α-CD115抗体对组织原位巨噬的有一个优先的清除效果，也清除掉了部分的MoMF。尽管和未给抗体组相比，给了抗体之后TAC引起的MoMF增加在TAC day3的时候还比较少，但在TAC后day7的时候，给抗体组的MoMF已经恢复到和未给抗体组差不多的水平。但是组织原位巨噬细胞被持续清除。
外周血中的单核在第二次给抗体后4天就恢复了（附件），提示心脏中MoMFs的恢复依赖于外周血循环的quick replenishment。
Fig 4C：在验证了抗体对组织原位巨噬细胞的清除效果之后，作者对注射了α-CD115或isotype control antibodies的小鼠进行了TAC，并取TAC后7天的心脏进行了CyTOF检测。和isotype组相比，TAC组小鼠心脏巨噬出现了非常明显的下降。
Fig 4D：随后作者使用免疫荧光检测了组织原位巨噬细胞marker CD163的表达，结果提示TAC后小鼠心脏中组织原位巨噬细胞出现明显增加，在α-CD115抗体清楚后出现显著下降。
Fig 4E：尽管成功清除了心脏组织原位巨噬细胞，TAC后七天小鼠没有检测到明显的心肌肥厚，也没有出现明显的EF，FS的改变。
这些结果提示α-CD115抗体可以有效清除组织原位巨噬细胞，而MoMFs则不受影响。
小结：清除组织原位巨噬细胞不影响1w TAC鼠的心脏肥厚和心功能，但不排除清除组织原位巨噬细胞仍然可能参与压力负荷下晚期心功能失代偿。
5. Resident Macrophages Inhibit Fibrosis
尽管组织原位巨噬细胞似乎在心脏应对压力负荷的早期肥厚过程中可有可无，但已有文献显示它们仍然可能在增加微血管密度和纤维化过程中起到重要作用。所以接下来作者探究了心脏巨噬细胞对血管生成和纤维化的调控作用。
Fig 5A：作者分离了Sham和TAC小鼠的心脏巨噬细胞，使用流式检测了它们促炎细胞因子TNF-α, IL6和IL10的表达。TAC小鼠心脏巨噬细胞出现了IL-6和IL-10的高表达，提示总体的炎症激活。
Fig 5B：TAC小鼠心脏巨噬细胞促纤维化指标Tgfb1的表达也增加
Fig 5C D：随后作者检测了是否清除组织原位巨噬细胞可以影响TAC后纤维化的发生。结果显示TAC鼠心脏和Sham相比出现明显纤维化，但清除心脏组织原位巨噬之后心脏纤维化加重。
Fig 5E：为了探究是TAC后的巨噬释放了哪些因子促进了纤维化的发生，作者分离了巨噬细胞使用bead-based immunoassay检测了十个分子的表达。结果提示和Sham鼠相比，TAC鼠心脏巨噬细胞多种细胞因子表达都出现了增加，包括TGFβ1和IL10这两种既往报道和纤维化相关的分子。
Fig 5F：TGFβ1和IL10这两种细胞因子都可以刺激myofibroblast分化，成熟和纤维产生，而且是剂量依赖性的。
小结：Together, these results show that cardiac macrophages play a critical role in ameliorating fibrosis in response to pressure overload.
6. Resident Macrophages Stimulate Angiogenesis
探究心脏巨噬细胞是否影响血管生成
Fig 6A：TAC鼠心脏巨噬细胞Vegfa表达增加
Fig 6B：TAC鼠血管生成增加，清除组织原位巨噬后血管生成减少
Fig 6C：为了验证巨噬细胞对血管生成的直接作用，作者分离了TAC鼠心脏巨噬细胞和HUVECs（人脐静脉内皮细胞）共培养。结果显示macrophages stimulated tube formation with increases in mesh area, and number of nodes, junctions, and meshes compared with the negative control，而且这个效应也是剂量依赖性的。
小结：These results show that cardiac macrophages promote vascular growth in pressure-overloaded hearts.
7. Recruited Monocyte-Derived Macrophages Stimulate Fibrosis
前面观察到α-CD115抗体主要清除组织原位巨噬细胞而且α-CD115抗体treated TAC小鼠出现纤维化加重的表现。但α-CD115也可以部分清除MoMF，因此作者推测MoMF可能也参与了TAC后纤维化的发生。
Fig 7A：实验设计。
Fig 7B：流式检测注射了α-CD115或isotype control antibodies的C57和CCR2 KO的TAC鼠心脏。CCR2KO鼠心脏的MoMF明显缺陷。
Fig 7C：早期清除组织原位巨噬细胞对心脏早期肥厚和心功能影响不大，和前面的结论一致。
Fig 7D：给了α-CD115的c57鼠纤维化增加，和前面结论一致。但α-CD115–treated CCR2KO 鼠（缺乏组织原位巨噬和MoMF）纤维化水平反而出现了下降。
小结：These findings indicate that recruited MoMFs are strong promoters of cardiac fibrosis in a process that ultimately depends on the counteracting role of resident macrophages.
8. Depletion of Resident Macrophages Leads to Accelerated HF Development
前面做的都是清除巨噬的短期效果，这里作者也对长期效应(TAC 6w)做了检测。
Fig 8A：对注射了α-CD115或isotype control antibodies的TAC 6w心脏进行了质谱流式检测，各类细胞数目已经没有明显差别。
Fig 8B：各类巨噬亚群的比例也没有差别
Fig 8C：但是和给了isotype control的TAC鼠相比，给了α-CD115抗体的TAC在6w时出现了EF和FS的进一步恶化，但心脏肥厚没有加重。
Fig 8D：尽管整体肥厚没有加重，给了抗体的TAC鼠心肌面积更大
Fig 8E F：给了α-CD115抗体的TAC鼠心脏纤维化更重
