CmMYB6有丝分裂遗传表观遗传修饰调控菊花花青素的生物合成

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花青素7个

导读

花色是观赏植物的重要性状，由各种化学色素决定，花青素是其中的主要成分。然而，花青素生物合成的表观遗传调控机制目前仍知之甚少。本研究在菊花栽培中发现一株通过无性生殖产生有黄花（YP-Y）和粉花（YP-P）子代的异色菊花（YP）。本研究旨在阐明YP植株后代不同花色的表观遗传机制。代谢组和转录组分析表明，YP-Y和YP-P的花色差异是由花青素生物合成基因CmMYB6的表达差异引起的。重亚硫酸盐测序结果显示，YP-Y的CmMYB6启动子甲基化程度高于YP-P，尤其是在CHH背景下。通过dCas9-TET1cd系统对CmMYB6启动子进行去甲基化处理后，花色由黄色恢复为粉红色。此外，在连续三代的YP-Y中，CmMYB6启动子的甲基化状态较高，表明这种甲基化状态是有丝分裂可遗传的。最后，对其他菊花品种的研究表明，CmMYB6的甲基化随花青素含量的增加而逐渐降低。这些结果为园艺植物花色改良奠定了表观遗传学基础。
论文ID
原名：Mitotically heritable epigenetic modifications of CmMYB6 control anthocyanin biosynthesis in chrysanthemum
译名：CmMYB6有丝分裂遗传表观遗传修饰调控菊花花青素的生物合成
期刊：New Phytologist
IF：10.323
发表时间：2022年7月
通讯作者：张旸，李玉花，张庆祝
通讯作者单位：东北林业大学
DOI号：10.1111/nph.18389
实验设计

结果

1 相同遗传背景下YP-Y株系的花青素浓度低于YP-P株系

本研究者在菊花育种中发现了一株具有黄色和粉色花的植株（以下简称YP）（图1a）。作者利用脚芽插条从YP植株繁育出黄色和粉色的异色株系（图1a）。为了跟踪花色转变过程，本研究定义了从花蕾到完全开放的花六个不同的花发育阶段（图1b）。YP-Y和YP-P株系从S4期开始往后花色差异明显。本研究作者用色度计测量YP-Y和YP-P株系的花瓣颜色。作者之后将完全开放的花（S6）的花瓣颜色在红、绿、蓝（RGB）标尺上进行校准，确定YP-Y和YP-P花瓣的RGB具体值为#F9F27B和#DB5282。按照青色、品红、黄色和黑色（CMYK）的色阶，#F9F27B是由0%青色、2.8%品红、50.6%黄色和2.4%黑色组成，而#DB5282是由0%青色、62.6%品红、40.6%黄色和14.1%黑色组成，这表明YP-P的粉色花颜色是由于在YP-Y的黄色基底上添加了一些紫色（由品红和黑色混合得到）造成的（图1c）。为了证实这一结果，作者通过测定S4期两个无性系花瓣的类胡萝卜素、黄酮醇和花青素含量，分析不同颜色的化学特征。结果与预期一致，YP-Y和YP-P株系的类胡萝卜素和黄酮醇含量没有显著差异。而YP-P花瓣的花青素含量显著高于YP-Y花瓣（p＜0.001；图1d）。为了进一步证实两个无性系之间花青素含量的差异，作者对YP-Y和YP-P株系的花瓣进行了非靶向代谢组学分析。结果表明，两株系间花瓣颜色的差异是由花青素含量的差异引起的（图1e）。因此，花青素的生物合成是菊花颜色异质性的关键。

为了进一步证实YP-Y和YP-P株系具有相同的遗传背景，作者随机选取了6个栽培品种（3个黄花品种YP-Y-like’和3个粉花品YP-P-like），以及3个YP-P和3个YP-Y植株，用于SLAF-seq分析（图1f）。结果表明，YP-Y和YP-P聚类在一起，而其他6个样品从YP-Y和YP-P株系中分离出来并分散。作者通过全基因组SNP分析随机获得的两个序列片段利用CAPS标记进行验证（图1g）。YP-Y和YP-P株系间的CAPS标记差异不显著，但与其他6个品种有显著差异。这些结果表明，YP-Y和YP-P具有相同的遗传背景，排除了YP-Y和YP-P株系间花青素积累差异是由基因突变导致的可能性。

图1.两个具有相同遗传背景的菊花株系间的花色差异是由于花青素积累的差异造成的。（a）菊花无性繁殖模型及不同类型花瓣在单株中的色素沉积。嵌合花株系（YP；中），黄色花株系（YP-Y；右）和粉色花株系（YP-P；左）。标尺，4cm。（b）YP-Y和YP-P花的六个不同发育阶段（S1-S6）是根据花瓣展开的程度来确定。标尺，4cm。（c）YP-Y和YP-P株系的CMYK彩色图。YP-Y花朵由0%青色、2.8%品红色、50.6%黄色和2.4%黑色组成。YP-P花是由0%青色、62.6%品红色、40.6%黄色和14.1%黑色组成。（d）YP-Y和YP-P株系的花瓣色素含量。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（，p＜0.001；ns，不显著（p*＞0.05）），星号代表显著性差异。利用S4发育期的花瓣进行颜色评价。（e）YP-Y与YP-P株系间代谢物含量比值。轨迹上的竖线表示YP-P与YP-Y代谢物含量的比值。小提琴内的水平线代表中线；下图和上图分别表示最小值和最大值。小提琴的宽度表示数据分布的密度。（f，g）8份菊花材料（包括3份YP-Y-like和3份YP-P-like）的单核苷酸多态性（SNPs）（f）和酶切扩增多态序列（CAPS）（g）的主成分分析。图（d-g）的花瓣采自于S4发育期。

2 CmMYB6的低表达导致YP-Y株系CmDFR、CmANS和Cm3GT的低表达

为了进一步探究YP-Y和YP-P株系不同花色的分子基础，作者通过qPCR分析了这些株系花青素生物合成基因的表达。下游结构基因CmF3H、CmDFR、CmANS和Cm3GT在YP-P中的表达量显著高于YP-Y株系，而上游结构基因CmCHS、CmCHI和CmF3’H的表达量在两株系间无显著差异（图2）。其他结构基因也没有显著差异。

之前的研究已经证明CmF3H、CmDFR、CmANS和Cm3GT受到CmMYB6转录因子调控，CmMYB6转录因子是MBW三重复合物的一个成员。因此，作者关注了MBW复合物的所有三个基因组分，CmMYB6、CmbHLH（basic helix-loop-helix）和CmWD40，检测它们在YP-P和YP-Y株系中的表达水平（图2b）。有趣的是，CmMYB6在YP-P株系中的表达量显著高于YP-Y株系；而CmbHLH和CmWD40基因的表达量在两个株系间无显著差异。而且，其他的MYB基因的表达量在两个株系间也无显著差异。这些结果表明，两个株系间CmMYB6的表达差异导致了CmF3H、CmDFR、CmANS和Cm3GT的差异表达，从而导致两株系间花青素的差异积累。

为了进一步验证CmMYB6在花青素积累中的作用，作者在烟草（Nicotiana tabacum）叶片中进行了瞬时表达分析。作者利用CmMYB6和已证实在番茄中起作用的bHLH转录因子SlAN1共转化烟草叶片。与空载体对照相比（4.50mg/g鲜重（FW）），表达35S:CmMYB6的叶片花青素相对含量显著升高（37.60mg/g FW），其中共转化SlAN1和CmMYB6的叶片花青素含量最高（171.58mg/g FW），表明两株系间CmMYB6的差异表达是导致它们花色差异的主要原因。

图2.黄色花（YP-Y）和粉色花（YP-P） 株系中11个花青素生物合成相关基因的比较表达谱。（a）菊花花青素合成途径示意图和两株系间CmMYB6调控基因差异表达的热图。（b）YP-Y和YP-P株系中花青素生物合成相关基因的表达水平。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（，p＜0.05；，p＜0.01；，p＜0.001；ns，不显著（p＞0.05）），星号代表显著性差异。RNA提取自S4发育期的花瓣。

3 YP-Y株系中CmMYB6的低表达与其启动子高度的DNA甲基化有关

为了确定CmMYB6在两株系间的差异表达是否与其突变有关，作者扩增并克隆了两个株系的CmMYB6启动子区（位于TSS上游2655 bp）和CmMYB6基因，并对其进行了测序。序列分析表明，两个株系间的CmMYB6基因和启动子区域相同。

因为YP-P和YP-Y具有相同的遗传背景，作者假设两个株系间CmMYB6表达的差异是由表观遗传调控机制引起的。为了验证该假设，作者通过McrBC-PCR检测了两个株系中CmMYB6启动子两个区域（TSS（+1 bp）上游的-2778到-1976 bp和-1659到-681 bp）的DNA甲基化程度（图3a）。结果表明，YP-Y中CmMYB6启动子的DNA甲基化水平高于YP-P株系（图3b）。作者还通过重亚硫酸盐测序检测了CmMYB6启动子区域（-1978到-1500 bp）的DNA甲基化状态。结果表明，YP-Y株系CmMYB6启动子在CHH环境下的甲基化程度（总甲基化=55.15%）高于YP-P株系（总甲基化=7.24%）（图3c，e）。在CmMYB6的启动子区域发现了24个nt siRNAs不同程度的富集（图3d，f）。表明DNA甲基化可能参与CmMYB6的表达调控。

为了验证这一结果，作者使用CRISPR-dCas9-TET1cd去甲基化系统去除CmMYB6启动子区域的DNA甲基化。TET1是一种已被证实的去甲基化酶。作者设计3×sgRNA引物引导dCas9-TET1cd融合到CmMYB6启动子区域。该去甲基化系统以CmMYB6启动子的三个位点为靶点，这些位点被认为能够消除甲基化。该去甲基化系统成功去除了CmMYB6启动子区域的甲基化，从而增加了CmMYB6的表达量和花青素的生物合成（图4）。

图3.黄色花（YP-Y）株系中花青素生物合成途径受到表观遗传修饰的调控。（a）CmMYB6基因结构示意图。用重亚硫酸盐测序（BSP）和引物（McrBC-1和McrBC-2）分析了CmMYB6基因区域。比例尺，200 bp。转座子从左到右依次是hAT-N10_STu、hAT-14_CPB、hAT-85_HMa、DNAV-1f_LVa、DNA-11_HM、DNA8-50_AP、L1-16_DR和hAT-2_TAcs。（b）利用McrBC-聚合酶链式反应（PCR）方法鉴定YP-Y和YP-P株系中不同甲基化水平的CmMYB6启动子区域。基因组DNA来自与S4发育期的花瓣。（c）重亚硫酸盐测序鉴定BSP区甲基化位点。红色、蓝色和绿色的点分别代表CG、CHG和CHH中的胞嘧啶碱基。实心圆点表示甲基化的胞嘧啶，圆表示未甲基化的胞嘧啶。（d）两株系间CmMYB6启动子区域富集的24个nt siRNAs的定量统计。（e）YP-Y和YP-P株系中CG、CHG和CHH环境中的DNA甲基化程度。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（，p＜0.01），星号代表显著性差异。（f）两株系中CmMYB6启动子区域24个nt siRNAs的富集程度分析。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（****，p＜0.0001；ns，不显著（p＞0.05）），星号代表显著性差异。

图4.*****CmMYB6*****启动子的去甲基化恢复了菊花中花青素的积累。（a）三个sgRNA区域分析CmMYB6基因的区域。比例尺，200 bp。（b）构建含有三个sgRNAs、dCas9蛋白和TET1的载体示意图。（c，d）CRISPR-dCas9-TET1cd体系处理（或未处理）黄花（YP-Y）中比较分析CmMYB6启动子甲基化（c）及CmMYB6的表达（d）。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（，p＜0.01），星号代表显著性差异。（e）浸花法和真空渗透法瞬时转化的菊花中花青素的积累。比例尺，2cm。

4 CmMYB6启动子区域的DNA甲基化是有丝分裂可遗传的

为了研究*****CmMYB6*****启动子的DNA甲基化状态是否具有有丝分裂可遗传性，作者研究2018-2020年连续三代无性繁殖的YP-Y和YP-P株系中的色素含量、花青素生物合成基因表达水平和*****CmMYB6*****启动子甲基化状态。结果表明，花色、色素含量、基因表达水平和*****CmMYB6*****甲基化状态的差异在两个株系中均能稳定保持连续3代（每一代*****n=*****3）中（图5）。

图5.*****CmMYB6*****启动子的表观遗传修饰在黄色花（YP-Y）和粉色花（YP-P）株系中稳定遗传。（a）YP-Y和YP-P株系连续三年的花的六个发育阶段。比例尺，2cm。（b，c）YP-Y和YP-P株系连续三年花瓣色素含量（b）和花青素生物合成相关基因表达量（c）的热图。（d）YP-Y和YP-P株系连续三年CmMYB6启动子甲基化水平比较分析。

5 菊花花色的多样性与CmMYB6基因的DNA甲基化有关

超甲基化状态抑制CmMYB6的表达，从而抑制花青素生物合成，导致花朵呈黄色。相比之下，CmMYB6在去甲基化状态的表达有利于花青素生物合成和形成不同的花色（粉色，红色和其他颜色）。为了验证*****CmMYB6*****启动子甲基化状态对花色形成的影响，作者对11个不同花色的菊花品种以及YP-Y和YP-P株系进行了代谢组学和转录组学分析。尽管能够鉴定出2个或3个不同的组，但是所有代谢物和所有unigenes的主成分分析（PCA）并没有根据花色将样品分成不同的组。另一方面，根据花色（白色、黄色和其他颜色（橘色、粉色和红色）），花青素相关代谢物的PCA将样品划分为三组（图6a）。另外，花青素相关unigenes 的PCA将样品分为两组，其中白色花和黄色花的植株聚在一起（图6b），表明尽管其他色素也参与了这一过程，但花青素在颜色形成中发挥着关键作用。

9个菊花品种能够划分为两大类别：一类是花青素含量高，另一类是花青素含量低。作者测定了两类品种中*****CmMYB6*****的表达量（图6c）和花青素含量（图6d）以及*****CmMYB6*****的甲基化水平（图6e）。测试结果将所有品种分为两组，一组为*****CmMYB6*****表达水平低、花青素含量低和*****CmMYB6***** DNA甲基化水平高的品种；另一组则与之相反（*****p*****＜0.0****5；图6c-e）。该结果清晰地表明，*****CmMYB6***** DNA甲基化在不同菊花品种中具有普遍性，且与花青素含量呈负相关。因此，*****CmMYB6*****甲基化状态的有丝分裂稳定性可能是调控菊花花青素生物合成的普遍机制。

图6.菊花花瓣的颜色与*****CmMYB6*****的甲基化有关。（a，b）11份不同花色菊花材料花青素生物合成途径相关的代谢产物（a）和基因（b）的主成分分析。白色，有白色花瓣的菊花；黄色，有黄色花瓣的菊花；其他，有橘色、粉色、紫色和红色花瓣的菊花。（c-e）9个菊花品种的CmMYB6表达量（c）、花青素含量（d）和CmMYB6甲基化状态（e）。误差线代表三个生物学重复的标准差。按照T检验（，p＜0.01；****，p＜0.0001），星号代表显著性差异。（e）9个菊花品种S6发育期花的表型。

讨论

本研究****作者****首次报道了菊花异色花发育的分子基础。遗传背景相同的两个株系（来自相同的亲本）通过无性繁殖可以稳定地保存不同的花色。然而，这两个株系在CmMYB6的表达水平上存在显著差异，CmMYB6能够调控花青素生物合成下游结构基因的表达。dCas9去甲基化系统直接证实了CmMYB6启动子的去甲基化导致花青素的积累，并且这种修饰能够稳定遗传给无性系后代。这一发现为菊花花色育种提供了一种新方法。无性生殖的不定芽再生是一种有效的植物繁殖方法；然而，它通常伴随着突变，也被称为后代的体细胞无性系变异。在观赏植物中，体细胞突变通常被称为芽运动。引起体细胞无性系变异的因素有很多，例如，DNA序列的点突变、序列拷贝数的改变、转座元件（TEs）的参与、DNA甲基化状态的变化、染色体重排和重组。先前的研究认为无性繁殖是表观遗传修饰的一个重要来源。MYB10 DNA甲基化导致的苹果果皮颜色变化被认为与芽运动有关。在杂色的非洲堇栽培品种‘Thamires’中鉴定出一个位于F3’5’H启动子区域的hAT转座子，而且组织培养过程中不同程度的转座子切除是F3’5’H表达水平和花色变化的基础。在马铃薯的连续培养中观察到代谢不稳定和花青素生物合成缺乏。本研究发现用菊花脚芽插条繁殖，显著修饰了CmMYB6启动子区域，导致花色发生改变。这些结果进一步支持和补充了以往研究的结果。作者鉴定了一个菊花的两个无性系YP-Y和YP-P，它们具有相同的遗传背景。这些无性系花青素生物合成相关的调控基因和结构基因未发生突变。YP-Y和YP-P花瓣的转录组和qPCR分析结果将颜色间的差异与*****CmMYB6*****表达水平的差异联系起来。此外，McrBC-PCR和CRISPR-dCas9-TET1分析表明，YP-Y和YP-P株系间的花色差异是由*****CmMYB6*****启动子的表观遗传修饰引起的（图3，4）。

在验证*****CmMYB6*****基因****被****DNA甲基化修饰后，****作者****分析了*****CmMYB6*****基因的启动子区****域****。由于菊花的基因组序列尚不可用，而栽培菊花的倍性水平复杂（通常为六倍体），因此很难确定CmMYB6基因启动子中甲基化的DNA环境。亚硫酸氢钠处理只测得了CmMYB6启动子序列的478 bp。该序列中，CHH环境下的胞嘧啶甲基化占总甲基化的73.85%，并且在两株系间存在显著差异（图3c，e）。已有研究报告指出，植物CHH甲基化的维持需要两条途径：RdDM-DRM2（靶向短TEs和长TEs的末端）和DDM1-CMT2（靶向长TEs的主体）。相关研究报告显示，CMT2介导的甲基化具有高度的随机性，并与环境温度的变化相关，而DRM2介导的甲基化随机性较低，且具有遗传性。本研究证明*****CmMYB6*****的甲基化可以通过无性繁殖遗传给下一代。因为CmMYB6启动子区域包含一个典型的短TE——hAT（图3a），作者推测CmMYB6启动子CHH甲基化的维持是受RdDM-DRM2途径调控的。研究表明，DRM2介导的甲基化伴随着包括组蛋白去乙酰化和H3K4甲基化的组蛋白修饰。某个位点的DNA甲基化是由24个nt siRNAs通过一个称为RNA导向的DNA甲基化（RdDM）过程触发的。在CmMYB6启动子中也检测到24个nt siRNAs的差异富集（图3d，f）。在未来的研究中，可以进一步分析RdDM通路。

本研究中，作者****利用CRISPR-dCas9-TET1cd表观遗传修饰系统，通过对菊花原生质体中*****CmMYB6*****启动子区进行瞬时表达分析，成功地实现了*****CmMYB6*****启动子区去甲基化。McrBC定量聚合酶链式反应分析显示，与空载体对照相比，表达dCas9-TET1cd质粒的细胞DNA甲基化程度显著降低，而CmMYB6基因的表达水平则相反（图4）。这证明了DNA甲基化抑制CmMYB6的表达。为了进一步验证*****CmMYB6*****启动子区域甲基化状态对花青素生物合成的影响，作者通过浸花法和真空渗透法利用农杆菌侵染菊花未开放的花蕾。结果表明，YP-Y株系的花青素的积累得到恢复。因此，dCas9-TET1cd工具可以通过激活DNA甲基化沉默的基因来创建新的稳定的表观等位基因，为菊花花色改良和品种开发提供分子育种依据。

本研究****结果表明，*****CmMYB6*****基因在多份菊花材料中均存在甲基化现象，可作为菊花育种和改良的分子标记****。因此，可以根据CmMYB6的甲基化状态对菊花花色进行初步评价，并可用于确定菊花后续花色育种的类型，通过改变CmMYB6的表观遗传修饰状态来实现菊花花色的改良。本研究结果可为今后园艺植物的选择和花色改良提供依据。

综上所述，****作者研究了****同一****株****菊花异色花的分子基础****。YP-Y和YP-P两株系间的花色差异主要是由于*****CmMYB6*****表达水平的差异，进而导致花青素生物合成的差异。两株系间*****CmMYB6*****表达差异是由于****其****启动子区域甲基化程度不同导致的（图7）。CmMYB6*****的甲基化状态在YP-Y株系和其他不同花色的菊花品种中均能够通过无性繁殖稳定的遗传。这表明DNA甲基化修饰是有丝分裂稳定遗传的。本研究通过组织培养和一系列的表观遗传学分析揭示了菊花花青素表达多样性的一般表观遗传学机制，启发作者思考是什么导致了表观等位基因的形成，以及它们是否是减数分裂稳定遗传的。为了验证这种表观遗传修饰是减数分裂稳定的，在未来的研究中作者将尝试杂交两个菊花品种。然而，本研究最关注的问题是什么导致了CmMYB6*启动子区域的DNA甲基化。在大田试验中，作者发现YP-Y的花青素产量随着温度的降低而增加。在植物中，尤其是观赏植物中，温度变化引起的花色变化并不少见。因此，温度是否影响以及如何影响菊花的花色性状，以及这一现象是否涉及到其他基因位点和其他类型的表观遗传修饰，如组蛋白修饰，是值得进一步研究的有趣课题。

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图7.菊花花色形成的分子基础示意图。CmMYB6启动子的甲基化影响花青素的积累。当CmMYB6启动子甲基化时，开关处于‘OFF’状态，从而抑制花青素积累。相反，当CmMYB6启动子未甲基化时，开关处于‘ON’状态，有利于花青素积累。

菊花是一个高度杂合的同源六倍体，这限制了甲基化遗传力的研究。此外，由于菊花的基因组序列尚未公布，除了CmMYB6以外的其他花青素生物合成基因是否受到甲基化的影响尚不清楚。因此，需要进一步的研究来解决这些局限性，更好地理解菊花花青素生物合成的表观遗传机制。