单细胞核测序：肌萎缩的转录异质性图谱
骨骼肌萎缩是多种疾病的临床症状之一，其特点是肌肉质量和收缩功能的丧失，这会导致患者的生活质量下降以及死亡率的上升。因此，了解萎缩性肌肉的细胞转录组特征对于探索肌萎缩的分子机制和制定相应的治疗策略至关重要。本文中，研究者利用单细胞核转录组测序技术描绘了失神经肌肉纤维的转录异质性，确定了肌肉组织中细胞群体独特的萎缩反应基因特征，并揭示了失神经肌肉纤维和其他驻留细胞中未描述的多样性，为治疗失神经或其他相关分解代谢因素引起的肌肉萎缩提供了潜在的细胞和分子靶点。
文章详情
文章题目：Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution
中文题目：单细胞核转录组测序解析失神经肌肉的转录组
发表时间：2022.06
期刊名称：J Cachexia Sarcopenia Muscle
影响因子：12.190
实验平台：10x Chromium 单细胞核转录组测序、IHC
DOI：10.1002/jcsm.13023
研究思路
研究内容
· 正常和失神经肌肉的异质性和细胞类型组成
为了研究萎缩和肌肉细胞异质性之间的关系，研究者构建小鼠坐骨失神经模型（导致 I 型和 II 型肌纤维严重萎缩），并收集腓肠肌样品进行10x 单细胞核转录组测序，共获得29539个细胞核转录组数据（正常3只，模型3只），聚类后得到30个clusters，注释成12种已知细胞类型。在正常组织中，II型肌核比例最高。失神经后，I和II型肌核、内皮细胞和周细胞比例降低，纤维成脂祖细胞（FAP）、巨噬细胞和未分类细胞核比例上升。其中，未分类细胞核表达多种细胞类型的特征基因，可能是多个细胞谱系的混合群体。拟时序分析则在肌核、FAP和内皮细胞发现细胞动态轨迹，失神经延长了肌核的轨迹，而FAP和其他驻留细胞轨迹受到影响较小，表明失神经导致肌纤维的转录和异质性变化更为明显。
Fig.1 正常和失神经腓肠肌的核/细胞类型分类
· II型肌核异质性对失神经的反应
拟时序分析进一步探究发现正常组织中，II型肌核呈从IIa延伸到IIx的连续轨迹，接下来是IIb1和IIb2。而在模型组中这一轨迹发生显著变化，且IIb2型肌核比例的显著增加，意味着在II型肌纤维中，失神经促进了肌核向特化IIb2型核的转变。差异比较分析和IHC染色揭示IIb1和IIb2型肌核存在于同一肌纤维中。失神经后，IIb2型核中几个肌萎缩相关基因，钙信号、MAPK和HIPPO通路在失神经的IIb2肌核中富集，GSEA表明涉及氧化磷酸化和缺氧的标志性基因集在正常IIb1肌核中丰富，而在失神经IIb2肌核中下调。相反，带有涉及TGF-β和MYC信号的基因的标志集在失神经IIb2型肌核中显著丰富。SCENIC分析在II型肌纤维中鉴定到147个活跃调节子，且所有肌核可以被划分为预期的亚型，这与使用轨迹分析获得的聚类结果一致。这些结果表明，在II型肌核中，失神经激活了独特的基因调控网络，驱动了纤维类型特异性转录变化。
Fig.2 轨迹显示了II型肌核转录的异质性
Fig.3 正常和失神经状态下IIb2型肌核的基因调控网络
· 失神经的I型肌核的转录和异质性改变
I型肌核轨迹分析发现其没有节点和分支，说明异质性低。受失神经影响的I型核形成了与正常组不同的cluster，反映了失神经对转录组的显著改变。Kegg分析表明失神经的I型肌核差异表达基因（DEG）与蛋白质降解、自噬、AMPK、mTOR和胰岛素信号转导等被证明与肌肉萎缩有重要关系的途径有关。GSEA揭示I型肌核中脂肪酸代谢、氧化磷酸化等通路在正常组织中丰富但在失神经组织中下调。SCENIC分析发现在正常I型纤维中优势基因调控网路中的调控子在失神经中下调，而CEBP-β，δ，γ和ζ调节子被显著激活，这与先前报道的C/EBPβ促进肌肉萎缩相关基因在癌症恶病质中的表达一致。
Fig.4 I型肌核对失神经的转录反应
· 失神经的I型肌核的转录和异质性改变
I型肌核轨迹分析发现其没有节点和分支，说明异质性低。受失神经影响的I型核形成了与正常组不同的cluster，反映了失神经对转录组的显著改变。Kegg分析表明失神经的I型肌核差异表达基因（DEG）与蛋白质降解、自噬、AMPK、mTOR和胰岛素信号转导等被证明与肌肉萎缩有重要关系的途径有关。GSEA揭示I型肌核中脂肪酸代谢、氧化磷酸化等通路在正常组织中丰富但在失神经组织中下调。SCENIC分析发现在正常I型纤维中优势基因调控网路中的调控子在失神经中下调，而CEBP-β，δ，γ和ζ调节子被显著激活，这与先前报道的C/EBPβ促进肌肉萎缩相关基因在癌症恶病质中的表达一致。
Fig.5 正常和失神经肌肉的肌核代谢图谱
· 失神经FAP的异质性和表型
对FAP进行轨迹分析，发现失神经后，从主轨迹中形成了三个分支，暗示了FAP的转录变化。分析FAP三个亚群的正常和失神经细胞基因的表达差异，发现在正常FAP中，富集了与肌肉发生、缺氧和代谢相关的特征，但都在失神经FAP中下调。此外，作为对失神经的反应，这些亚群富集了不同的基因集。失神经激活C2和C3 FAP以使其分别获得促纤维化和促脂肪生成的特征。在正常和失神经FAP中发现了297个活性调节子，失神经导致正常FAP中最活跃的调节子被抑制，伴随着其他调节子的适应性激活，特别在C3中有超过120个调节子被强烈激活，其中一些特定的调节子可能驱动FAP的表型变化。此外，研究者还发现C2 显示出更高的STAT3调节蛋白活性，据报道可在失神经期间促进肌纤维萎缩和纤维化，并且还发现了几个新的调节子在失神经后FAP中活性显著增加，其作用有待进一步研究。
Fig.6 FAPs对失神经的转录反应
· 失神经肌肉中巨噬细胞的表达改变
在正常和失神经肌肉中，巨噬细胞（MPs）是主要的炎性细胞，分为2个亚型：骨骼肌驻留和单核细胞来源MPs。在失神经肌肉中，巨噬细胞总数增加且驻留型MPs的比例明显升高。轨迹分析表明驻留型MPs产生了一个连续的轨迹，两个clusters对应正常和失神经的驻留MPs。差异分析、富集分析和GSEA表明失神经驻留MPs中与纤维化或免疫反应相关的基因上调表达，涉及免疫反应、趋化因子受体结合的基因集显著丰富。SCENIC分析结果说明失神经可能会增强肌肉驻留MPs的自我更新能力。
Fig.7 巨噬细胞对失神经的转录反应
· 肌纤维与其他驻留细胞之间的通讯对失神经的反应
为了探究失神经肌肉中细胞间互作关系，研究者利用配体受体互作分析在正常和失神经肌肉中分别推断出592和48个配体受体对，表明失神经对细胞通讯有明显的抑制作用。因为失神经诱导的分解代谢信号是在肌纤维中启动的，所以优先考虑从肌纤维到驻留细胞的互作信号。正常I型肌纤维表达较高的Fgf1、Mapt、Angpt1等配体，而II型肌纤维表达较高的Vefga、Fgf13、Cadm1。失神经配体受体相互作用显著下降，反映失神经减少了肌纤维对驻留细胞的影响。由于肌纤维分泌的Fgf1被认为是维持MuSCs功能的关键，结果表明，肌纤维中Fgf1的下调可能是导致MuSCs在失神经过程中功能障碍的机制之一。然而，研究者也在失神经的MuSCs中检测到MAPK通路的激活：KEGG分析显示失神经的MuSCs富集MAPK信号通路，而SCENIC分析捕捉到作为MAPK通路靶向转录因子之一的Ets1调节子的激活。这些结果表明，其他的FGF家族成员可能参与了MuSCs中MAPK信号的激活反映了肌肉失神经过程中MAPK信号的复杂调控。
使用相同的策略研究从驻留细胞到肌纤维的通信，发现在正常肌肉中有85对相互作用，在失神经肌肉中有25对相互作用，表明失神经也减少了从驻留细胞到肌纤维之间的通讯。在正常组织中预测到从巨噬细胞到I型肌纤维的互作，包括Itga4、Fn1、Ptprc和Tfrc间的互作，但是这些互作关系对被失神经抑制。由于Tfrc已被证明对肌肉发育和新陈代谢至关重要，结果表明巨噬细胞可能在维持正常肌肉内稳态方面发挥关键作用。失神经刺激巨噬细胞中某些配体的表达，这可能对肌纤维产生异常影响。FAPs是最大的驻留细胞群，依赖于环境的变化，它们能够分泌促肌生成因子和促萎缩因子，研究者鉴定到FAPs到II型肌纤维在正常组织中的交互作用，它们在失神经影响下互作强度降低。综上所述，失神经抑制了肌肉细胞间的整体通讯，同时也刺激了驻留细胞中促萎缩因子的表达，这可能导致失神经诱导的肌肉萎缩。
Fig.8 失神经后肌纤维与其他驻留细胞之间的配体-受体相互作用
主要结论
本研究利用肌肉萎缩的坐骨失神经小鼠模型，使用单细胞核转录组技术从正常和失神经小鼠中生成腓肠肌的单核转录图谱，共获得29539个肌肉细胞核，被分为13个类型。其中，IIb型肌核进一步分为两个亚群，命名为IIb1型和IIb2型肌核。失神经损伤后，IIb2型肌核比例显著增加。轨迹分析显示，失神经IIb2肌核明显偏离正常IIb2肌核，表明该亚群在失神经后经历了强烈的转录重编程。肌核的代谢图谱显示，大多数代谢途径被失神经影响而下调，而一些代谢信号，如谷胱甘肽代谢，在失神经的IIb2型肌核中被特异性激活。研究者还探究了I型肌纤维、肌肉干细胞、纤维脂肪祖细胞、巨噬细胞、内皮细胞和周细胞的转录变化，并表征了它们对失神经的特征反应。通过预测细胞间的相互作用，观察到肌纤维和肌肉驻留细胞之间的通讯因失神经而减少。综上所述，这些结果定义了与失神经诱导的肌肉萎缩相关的肌核转变、代谢重塑和基因调控网络重编程，并阐明了肌肉细胞对分解代谢反应的异质性和可塑性的分子基础，为探索肌肉萎缩的分子机制奠定基础。
参考文献：
Lin, Hongchun et al.“Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution.”Journal of cachexia, sarcopenia and muscle, 10.1002/jcsm.13023. 20 Jun. 2022
