一个基因不同isforms的引物设计

首先打开NCBI gene

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点进去输入基因名，此时注意种属。
点进去相关链接后，往下拉。

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看到这个以NM开头的就是mRNA，可见这几基因有4个转录本。

此时继续往下拉，

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此时出现了不同isforms的信息，选择你所感兴趣的，点击进去。我们以第一个为例。

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此时点击右侧的Pick primer

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进入此页面后，将PCR product size修改为350，其实500以内都行，qPCR反应中，延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算，30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降，所以保守起见，将最大产物长度设为350 bp甚至更低比较合适。太短也不行，否则跟引物二聚体分不开，所以下限70不用改。

接着往下拉

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改Exon junction span 让其跨越外显子，这个原因就不讲，大家都知道。

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接着就是get primer等待结果。等待时间1-5min不等。

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这个就是我们想要的primer。下面还有blast结果，这个步骤合成的primer的正确率100%。非常好用。

第二种情况就是，我们不需要分isforms，我们需要全部isforms的表达，这样的情况的设计primer的步骤如下：

1, 回到最初的NCBI gene，同样输入你的gene name，而后

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同样关注其isforms的情况，我们可以看出这4个isforms最短的一个包含了4个exon（一条绿色竖线表示一个exon）。这个基因特殊的是前面三个isforms是无法使用常规引物分开的，所以我们就默认为2个，其实扩增出来就是全部的。随后随便点击一个isforms的连接进去下一步。

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比如我们现在还是选择第一个。

进入后，进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前，点击Highlight Sequence Features。

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此时出现序列，选择第4个exon，记录第4个exon所在的碱基位置418.

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而后回到上方，点击pick primer.

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随后在图中所示的位置输入刚记录下来的数字418，截图有误，应该是418.

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其他按照与前面一样设置的变量类型，然后get primer

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上图的方框全部打钩，提醒你这个isforms也会被扩增出来。就会得出一个总的isforms的pcr primer。