免疫组化的浓度梯度摸索，知多少？

2019年2月14日，星期四，晴
今天是情人节，有对象（含老婆、女朋友、暗恋对象）的，不要忘了表现一下哦，祝天下有情人终成眷属～当然单身狗的，可以去万能宝买个“娃娃”爽一下！
言归正传，关于免疫组化的浓度摸索，我也还在学习过程中，现在拿出来分析，希望大家一起探讨一下。
以下是一组免疫组化的图片，第一张是试剂阴性组（未加一抗），余下为不同浓度染色情况，请您说哪个浓度最佳？最好可以提供依据。

试剂阴性对照组，也就是未加一抗
浓度为1：400 浓度为1：600 浓度为1：800 浓度为1：1000 浓度为1：1300 浓度为1：1600

医博云天的观点：
首先，浓度摸索是有依据的，每个抗体买回来之后，打开说明书，上面都有提供抗体染色部位和抗体稀释比例范围，而你要做的是在这个范围内找出最佳值。当然好一点的抗体公司，还会提供相关的阳性对照组的（即在什么组织上，什么稀释比例，阳性结果的表达情况图片），这个非常关键！为什么呢？一是将来发文章时，要提供阳性对照组的图片（当然是你自己做的，你不是说明书上的）；二是你可以以此为基准，做梯度稀释，然后做一组数据，比较出最佳浓度！
（最好是在说明书上说的组织标本上摸索，如果实在找不到这种组织，那也只能在自己组织上直接做了）
其次是，这个抗体的染色部位为细胞核，从几张阳性图看，细胞核染色情况差不多（判断同一个部位细胞核染色的深浅和范围），所以说明抗体特性比较好（可能拍摄角度有点问题，会影响你们的判断）。如果抗体特异性不佳，那可麻烦了，要更换抗体，比如从多克隆改为单克隆！
最后，这些图片的背景都不是很干净，在细胞以外都有一些非特异性染色。考虑有几种情况：一是内源性过氧化物酶没有处理好，导致背景染色，其应对方案可以考虑加强血清封闭。二是DAB显色时间过长，其应对方案可以考虑缩短显色时间。三是在阴性对照组的结果中也出现了背景染色，故暂不考虑抗原修复方式不佳所致。四，与阴性对照组相比，浓度为1：1000的背景染色最为清晰和接近，故认为该浓度比较适合（抗体说明书也是建议这个浓度，简直太好了）。因为，当抗体浓度不佳时，也会导致背景出现非特异性染色。

以上观点是个人观点，仅提供参考，欢迎斧正！