常用的蛋白共表达策略

1. 多启动子表达载体：在同一个载体中插入多个独立的转录单元，每个转录单元有自己的启动子和ORF。缺点是基因表达水平不平衡，在某些细胞系中。启动子之间产生干扰，甚至发生基因重排，而且转录单元数有限制。

2. 剪切载体：利用同一个启动子，形成一个完整的转录本；初级转录本在剪切信号处断裂形成独立的次级mRNA，分别翻译成不同的蛋白。缺点是剪切信号机制不清楚，很难控制，该方法不常用。

3. 融合蛋白：将多个蛋白顺序连接，在同一个启动子的转录下，形成一个完整的转录本。翻译成一个融合蛋白。缺点是：因为产物是融合蛋白，可能会影响某个蛋白的功能。

4. 插入蛋白酶切位点：Furin是真核细胞中高度保守的一种蛋白酶，定位在高尔基体上，能特异性识别Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg位点。利用这个特性，可以在蛋白连接处加入这个蛋白酶识别位点，这样融合蛋白翻译后在高尔基体处被Furin所切割。缺点是：由于Furin定位在高尔基体上，内质网和高尔基体加工的蛋白通常是分泌蛋白和膜结合蛋白，生物体中还有相当数量的蛋白存在细胞质中的,并不都需要内质网和高尔基体加工，这极大的限制了该方法的应用。

5. 加入IRES：同一个启动子，不同的ORF通过IRES连接。翻译出多个蛋白。缺点是：IRES上游的翻译效率往往高于下游基因的翻译效率，常用的EMCV的IRES长度约~570bp，比较大，也限制了该方法的应用。

6. 自裂解多肽2A：2A多肽发现与多种病毒当中，长度一般为18-22氨基酸。在C端编码一个高度保守的共有基序（Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-//-Pro）剪切位点位于Gly-//-Pro之间。剪切的原理是2A的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间排阻，阻止Gly和Pro之间形成肽键，但是核糖体依然可以继续下游的翻译，整个过程不需要其他蛋白酶的参与。目前常用的2A序列有FMDV, ERAV, PTV-1, TaV。其中FMDV最常用，也研究的最深入。

Furin蛋白酶

• Furin是一种蛋白酶，该基因被称为 FUR（FES 上游区域），因此该蛋白质被命名为弗林蛋白酶。有些蛋白质在第一次合成时是无活性的，必须去除部分才能变得有活性。弗林蛋白酶切割这些部分并激活蛋白质。它被命名为弗林蛋白酶，因为它位于称为FES的癌基因的上游区域。

• Furin是真核细胞中高度保守的一种蛋白酶，定位在高尔基体上，能特异性识别Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg位点。利用这个特性，可以在蛋白连接处加入这个蛋白酶识别位点，这样融合蛋白翻译后在高尔基体处被Furin所切割。缺点是：由于Furin定位在高尔基体上，内质网和高尔基体加工的蛋白通常是分泌蛋白和膜结合蛋白，生物体中还有相当数量的蛋白存在细胞质中的,并不都需要内质网和高尔基体加工，这极大的限制了该方法的应用。

  
  切割序列（R-X-K/R-R）

https://www.novopro.cn/articles/201704261148.html
https://en.wikipedia.org/wiki/Furin