Li N, Chen S, Yan Z, et al (2021) Antimicrobial Activity and Identification of the Biosynthetic Gene Cluster of X-14952B From Streptomyces sp. 135. Front Microbiol 12:. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.703093

链霉菌属是抗生素的重要来源，基因组挖掘是探索链霉菌属微生物生物合成潜力的重要工具。本研究报道了一株从中国青藏高原分离的放线菌菌株135，该菌株具有广泛的抗菌活性。菌株135发酵液在体外对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、苹果腐烂病Valsa mali、辣椒疫霉Phytophthora capsici、扣带球孢菌Glomerella cingulata、稻瘟病菌Magnaporthe grisea、玉米小斑病菌Bipolaris maydis、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum具有较强的抗真菌活性（>70%），同时对油菜叶片、小麦和辣椒植株上的核盘菌、Gaeumannomyces graminis和辣椒疫霉有显著的防治效果，分别为54.04%和74.18%、90.66%和67.99%、79.33%和66.67%。X-14952B对核盘菌和禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的抑制活性最强，其50%抑制浓度（EC50）分别达到0.049和0.04μg/mL。利用多相【polyphasic】方法对菌株135进行分析，发现该菌株具有链霉菌属的典型特征。16S rRNA基因测序和系统发育分析表明，该菌株与Streptomyces huasconensis HST28(T)的亲缘关系最为密切，并形成一个分支（98.96%的16S rRNA基因序列相似性）。菌株135和相关类型菌株的平均核苷酸同一性（ANI）和DNA-DNA杂交（DDH）值均低于物种测定阈值（分别为91.39%和56.5%）。菌株135和相关类型菌株之间的OrthoANI处于决定物种的临界值（<95%）。通过基因组挖掘，确定了X-14952B生物合成的生物合成基因簇（BGC），并推断了可能的生物合成过程。

前言

放线菌作为一种微生物资源具有良好的开发潜力。从各种放线菌中分离出了许多结构多样的天然产物，几乎三分之二的天然抗生素和抗癌剂、杀虫剂以及医药中使用的抗菌剂都是由这一细菌群的成员生产的。放线菌在生物工程、医药、农业和其他行业中起着至关重要的作用（Aminov，2017）。链霉菌作为放线菌中最重要的属和最丰富的抗生素生产菌，从基于天然产物的药物发现的黄金时代开始就引起了人们极大的兴趣。随着发现链霉菌新物种的不断探索和对天然产物分离的不断增加的研究，即使是从系统发育不同的链霉菌中已重新发现已知的生物活性化合物。因此最新的研究趋势集中于开发新的筛选技术，以实现高效的去重复，并调查来自极端和未勘探环境中的稀有样品，与已知物种相比，这些环境中的微生物可能具有独特的特征，因此可能产生新的生物活性次级代谢物（Suzuki，2001）。极端和未开发的环境包括海洋环境（Yang等人，2020年）、山区（Wei等人，2020年）、沙漠（Sivakala等人，2021年）和雨林（Schneider等人，2018年）。
了解和分析适合产生次生代谢物的遗传信息是探索潜在天然产物的基础。测序技术的发展带来了快速、准确和相对廉价的测序。此外，计算算法的发展和次级代谢物相关数据库的扩展，通过自动扫描和注释代谢物的独特基因簇，进一步促进了天然产物通过基因组生物合成途径的挖掘和研究。

材料方法

基因组DNA和序列分析

按照制造商的说明，使用QIAGEN基因组探针（QIAGEN Biotech Co.，Ltd.）提取菌株135的基因组DNA。分别通过Thermo Scientific NanoDrop、Qubit和0.35%琼脂糖凝胶电泳对DNA纯度、浓度和完整性进行质量检查，然后使用连接测序试剂盒（牛津纳米孔技术有限公司）构建基因组DNA文库，用于纳米孔测序。使用Promethion测序仪48对文库进行测序。Canu v1.5（Koren等人，2017年）用于组装过滤子读长和Pilon v1.22（Walker等人，2014）用于以更高的精度纠正装配顺序。测序工作由Biomarker Technologies Co.，Ltd.完成。
使用Antismash 5.0（Blin等人，2019年）鉴定与次级代谢物相关的BGC。PKS/NRPS分析网站2用于分析和比对与X-14952B生物合成相关的结构域（VEN代表聚酮链合成基因）。Clustal X2用于对齐氨基酸序列。3.

系统发育分析与基因组比较

如Basilio等人（2003）所述，利用多相方法，包括培养、形态、生理和生化特征，在属水平上对放线菌进行鉴定。根据国际链霉菌项目指南（Shirling和Gottlieb，1966年）确定分离物的形态和培养特征。利用16S rRNA基因序列分析进行分类鉴定。获得组装基因组后，从全基因组序列中分离出菌株135的完整16S rRNA基因序列，并在链霉菌属中与从GenBank/EMBL/DDBJ数据库检索到的相关类型菌株的代表性序列对齐。在使用MEGA X软件（Kumar等人，2018年）通过邻接、最大似然和最大简约算法重建系统发育树之前，手动调整序列比对。Kimura的双参数模型用于计算最大似然和邻域连接系统发育树的进化距离（Nishimaki和Sato，2019）。基于Felsenstein（1985）的1000 bootstrap重采样方法，对生成的树进行稳定性评估。使用所有链霉菌基因组作为参考，序列相似性和DNA-DNA杂交（DDH）值分别由Chun Lab的在线平均核苷酸身份（ANI）计算器4和基因组-基因组距离计算器GGDCv 2.1计算（Meier Kolthoff等人，2013年）。

使用细菌泛基因组分析工具（BPGA；Chaudhari等人，2016年）分析核心、附属和独特的泛基因组同源群（POG）。使用USEARCH算法对POG进行聚类，将所有24个菌株的识别值设置为0.5。GGDC网站5用于建立菌株135和其他密切相关链霉菌物种的系统基因组树。使用MEGA X（Kumar等人，2016）和NJ法以及1000次引导复制，用对齐的氨基酸序列重建了泛、核心基因组树。计算了在泛、核心基因组树中形成一个分支的亲缘关系近的四个模式菌株(Streptomyces huasconensis HST28T, Streptomyces alboniger ATCC 12461T, Streptomyces kanamyceticus ATCC 12853T, 和Streptomyces formicae KY5T)与菌株135的OrthoANI值。Chun实验室的同源平均核苷酸识别工具（OAT）（Lee等人，2016年）由EzBioCloud数据库提供，用于计算OrthoANI值。所有基因组序列均从GenBank数据库下载。

结果

基于GenBank/EMBL/DDBJ数据库，初步选择了23株菌株和135株菌株进行泛基因组分析。结果表明，菌株135共享同源编码序列（CDS），并聚集在链霉菌的核心基因组中，这与之前的结果一致。因此，我们基于所有24个菌株的这些核心同源蛋白质构建了一个核心基因组树（补充图8）。链霉菌全基因组中的基因总数呈上升趋势，表明整个基因组是开放的。泛基因组和核心基因组的进展如补充图9所示。
最核心、最附属和最独特的POG与一般功能、转录和代谢等有关（补充图10）。泛基因组分析显示，菌株135和四个相关物种在核心基因组系统发育树的同一分支中形成，共有7287个POG：1704个POG核心、4719个POG附件和851个独特的POG，其独特和核心POG的数量如补充图11所示。