SUVmax可能被用作免疫炎症微环境的替代标志物

Standardized Uptake Value for 18 F-Fluorodeoxyglucose Is a Marker of Inflammatory State and Immune Infiltrate in Cervical Cancer

18 F-氟脱氧葡萄糖的标准化摄取值是宫颈癌炎症状态和免疫浸润的标志物

发表期刊：Clin Cancer Res

发表日期：2021 Aug 1

影响因子：13.801

DOI:  10.1158/1078-0432.CCR-20-4450

一、背景

        尽管在筛查和预防方面取得了重大进展，宫颈癌仍然是全球女性癌症死亡的主要原因。局部晚期宫颈癌的标准治疗方法，即联合顺铂化疗给予的确定性盆腔放疗（RT）。已经开发了许多宫颈癌的预后成像标志物，包括来自18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）和磁共振成像（MRI）的指标。之前已经证明，治疗后FDG-PET的持续性或进展性疾病是一种强有力的阴性预后标志物，并且与PI3K/AKT通路激活相关。原发性肿瘤的预处理最大标准化摄取值 (SUVmax)适合于此目的。有研究提出了其他可能更强大的PET指标，但SUVmax是临床报道最广泛，研究最广泛的，之前已经报道过其在宫颈癌患者中的预后意义。对与高 SUVmax 相关的原发性肿瘤生物学的更深入了解将进一步了解如何治疗高危癌症，并将 FDG-PET 信号从预后标志物转变为预测对特定治疗反应的标志物。

二、材料与方法

1.数据来源

1） SUVmax队列：确定了一个最具预后价值的SUVmax分界线，该分界线是接受最终RT治疗的宫颈癌患者队列；纳入的患者必须完成整个规定的确定性RT疗程

2） 全转录组RNA测序队列：被用来确定与高FDG摄取相关的过度表达的基因和途径

3） 组织微阵列免疫组化队列：包括其肿瘤样本被纳入组织微阵列（TMA），并可进行免疫组化（IHC）分析的患者

4） 两个人类宫颈癌细胞系：ME180和SiHa

2.实验流程

1） PET/CT成像和分析：宫颈原发肿瘤的SUVmax是通过确定包括原发肿瘤在内的感兴趣容积内的最大单体SUV来测量的

2） 临床数据的统计分析：通过面向结果的截断方法，利用α-调整的对数可能性检验，确定区分自由进展（FFP）良好与不良患者的最佳SUVmax；用Kaplan-Meier/log-rank和Cox单变量和多变量分析来评估该SUVmax对FFP、癌症特异性生存（CSS）和总生存（OS）的预后意义；进行自举Cox多变量分析，以更好地说明SUVmax在其他已知临床预后标志物背景下的意义

3） 基因集富集分析（GSEA）：对队列2中的患者进行了RNAseq分析；根据高SUVmax（≥11.41）和低SUVmax（<11.41）值的患者之间的倍数变化对表达的基因进行排序，并纳入GSEA分析

4） 细胞类型丰度分析：使用CIBERSORT评估了队列2种患者造血细胞相对丰度

5） 使用肿瘤微阵列评估宫颈肿瘤中免疫细胞群的流行情况：在人类宫颈癌肿瘤的TMA上对巨噬细胞和中性粒细胞的标记物进行了IHC

6） 组织培养、巨噬细胞共培养和条件培养基实验、Western blotting、荧光2-DG葡萄糖摄取试验

7） 细胞因子阵列分析：细胞因子通过人类发现分析法，使用13种细胞因子的阵列进行分析

三、实验结果

01 - 患者概况

        用于SUVmax分析的患者队列（队列1）由318名患者组成，用于RNAseq分析的患者队列（队列2）由68名患者组成，用于TMA的队列由82名患者组成。除8名患者外，队列2中的所有患者也包括在队列1中，队列3中除11名患者外所有患者也包括在队列1中。作者比较了仅包括在SUVmax分析中的患者与同时包括在SUVmax分析和RNAseq分析中的患者的特征，以及与同时包括在SUVmax分析和TMA分析中的患者的特征。这些组之间在诊断时的年龄、FIGO分期、FDG-PET的淋巴结受累情况、组织学或原发肿瘤SUVmax方面没有明显差异。

使用的每个患者队列中的患者数量，以及队列之间的重叠

        群组1的中位随访时间为3.2年，群组2为4.0年，群组3为5.1年。队列1的2年和5年总生存率（OS）分别为76.1%和66.8%；队列2的72.5%和56.5%；队列3的69.5%和56.1%。队列1中，2年和5年的癌症特异性生存（CSS）率分别为77.6%和70.7%；队列2中，2年和5年的癌症特异性生存率均为64.7%；队列3中，癌症特异性生存率分别为73.2%和61.0%。

02 - SUVmax的预后价值

        使用面向结果的截止方法，发现SUVmax<11.41是最能预测无进展（FFP）的。这与之前报道的与最差生存期相关的SUVmax 13.3相似。这个SUVmax分界点对CSS也有预后作用，但不是OS（图1a-c），而且对局部（宫颈）复发和任何盆腔复发也有预后作用。在Cox单变量分析中，发现SUVmax（≥ vs. < 11.41）、FIGO分期和PET上的淋巴结受累（主动脉旁 vs. 无）对FFP有预后作用。在FFP的多变量分析中，SUVmax、FIGO分期和淋巴结受累均有意义。

图1 SUVmax的预后意义

        作者还进行了自举多变量分析，以进一步确定SUVmax（≥与<11.41）在其他已知的临床预后变量中的相对预后意义；即诊断时的年龄、FIGO分期、治疗前FDG-PET/CT的结节受累和组织学。在队列1的1000个随机抽样中，SUVmax在63.3%的情况下被证明是一个重要的预后因素，FIGO分期在72.1%的情况下预示着特别差的预后，96.5% 的淋巴结受累，主动脉旁淋巴结受累是一个强有力的预后变量，而年龄和组织学在12.6和12.0%的情况下是一个重要的预后变量。

03 - 与高SUVmax相关分析

        一旦确定了SUVmax与预后的关系，作者对RNAseq数据进行了基因组富集分析（GSEA），以确定与高SUVmax相关的基因组。GSEA是将SUVmax作为二分变量（≥或<11.41）进行的。这里使用Hallmark基因集，它代表了明确的生物状态，显示出连贯的表达，并已使用计算方法生成。与高SUVmax相关的前3个Hallmark基因集是炎症反应、通过NF-κΒ的TNFα信号传导和JAK/STAT3信号传导（图2）。这些基因组中的许多基因之间存在重叠（即，基因存在于>1个基因组中）。此外，这些基因中有许多编码与特定免疫细胞亚群相关的细胞因子和趋化因子，包括骨髓系的细胞，特别是巨噬细胞（图2）。

图2 GSEA分析结果

        鉴于高SUVmax和与骨髓细胞群相关的炎症通路基因之间的关联，使用CIBERSORT算法对大量RNAseq数据进行了反卷积。中性粒细胞、单核细胞和NK细胞的相对比例在高低SUVmax组之间有明显的不同，高SUVmax组的中性粒细胞和单核细胞的比例较高，而NK细胞的比例较低（图3A），巨噬细胞的比例处于边缘显著（图3A）。鉴于GSEA中高SUVmax肿瘤中与巨噬细胞过表达相关的的基因数量，还研究了巨噬细胞亚群的预测患病率，发现在高SUVmax肿瘤中预测M2极化巨噬细胞的比例更高（图3B）。

04 - 宫颈癌TMA中巨噬细胞和中性粒细胞的患病率

        为了验证GSEA和CIBERSORT数据的发现，即高SUVmax与炎症途径和骨髓系的免疫细胞有关，作者对人类宫颈癌肿瘤的TMA进行免疫组化（IHC）染色，以确定免疫细胞亚群。特别关注中性粒细胞和巨噬细胞的表面标志物。CD68的表达被用作巨噬细胞的一般标记，2者之间有良好的一致性。CD68染色最少/阴性的肿瘤样本（≤1%）的平均SUVmax低于CD68阳性（>1%）的样本（图3C）。CD163的表达被用作M2极化巨噬细胞的标志物，CD163阴性的样本与阳性的样本之间的SUVmax没有显著差异。为了评估中性粒细胞浸润，将单独的 TMA 载玻片与 CD66b 和中性粒细胞弹性蛋白酶共染色；中性粒细胞染色的读者之间有良好的一致性。SUVmax与肿瘤微环境中的中性粒细胞浸润之间存在非显著的正相关关系（图3D）。

图3 CIBERSORT分析和组织微阵列的结果

05 - M0和M2巨噬细胞通过炎症信号传导途径改变人类宫颈癌细胞的葡萄糖代谢情况

        为了研究巨噬细胞、葡萄糖摄取和JAK/STAT3信号之间的关系，用12-肉豆蔻酸盐（PMA）将人单核细胞THP-1分化为巨噬细胞，然后用干扰素-γ（INF-γ）和脂多糖（LPS）进一步极化为M1巨噬细胞，或用IL-4和IL-13极化为M2巨噬细胞。然后将人类宫颈癌细胞（SiHa和ME180）暴露在巨噬细胞调理的培养基中，或与巨噬细胞共同培养在转孔板中。

        通过流式细胞仪用荧光2-NBDG测量葡萄糖的代谢情况。将ME180和SiHa细胞暴露在M0、M1或M2巨噬细胞条件培养基中，或将ME180和SiHa细胞与M0、M1或M2巨噬细胞共同培养，导致宫颈癌细胞对2-NBDG的吸收明显增加。这在两个细胞系与所有亚型的巨噬细胞中都能看到（图4A）。因此，作者评估了13种促炎症细胞因子和趋化因子的阵列，它们在这个跨孔系统（Eve Technologies）中被分泌出来，这表明巨噬细胞分泌的各种细胞因子都在增加。与单独的巨噬细胞相比，当巨噬细胞与宫颈癌细胞共同培养时，两种细胞因子，IL-1β和IL-6，显示出一致的增加（图4B）。4种细胞因子的结果没有显示（INFγ、IL-2、IL-4和IL-13），因为大多数情况下的信号太低，无法检测（INFγ和IL-2），或者单独来自ME180细胞的信号超过了来自巨噬细胞的信号几个数量级（IL-4和IL-13）。

        进一步探讨了IL-6对ME180和SiHa细胞中葡萄糖代谢的影响。已知IL-6能激活JAK/STAT3途径，导致STAT3磷酸化。ME180细胞没有显示基线STAT3磷酸化，但当与巨噬细胞或巨噬细胞条件培养基一起培养时，显示出STAT3磷酸化。SiHa细胞显示基线STAT3磷酸化，当与巨噬细胞和巨噬细胞条件培养基共同培养时，STAT3磷酸化没有变化或可能略微减弱（图4C）。当SiHa或ME180细胞与M2巨噬细胞共同培养时，用IL-6中和抗体（500纳克/毫升）处理SiHa细胞（D），以及用2-NBDG测量的葡萄糖摄取量减少（图4E）。

图4 宫颈癌细胞与巨噬细胞和巨噬细胞调理培养基共同培养时看到的葡萄糖代谢、细胞因子和趋化因子表达以及JAK/STAT3信号的变化

        最后，为了将JAK/STAT3信号与人类肿瘤中的葡萄糖代谢联系起来，重复了GSEA分析，根据STAT3的表达而不是SUVmax对表达基因进行排序，在STAT3高表达的肿瘤中，Hallmark糖酵解通路显著上调。

四、结论

        18F-氟脱氧葡萄糖预处理正电子发射断层扫描（FDG-PET）是评估宫颈癌的一个重要工具，最大标准化摄取值（SUVmax）是临床上广泛报道的一个指标。本研究中，利用前瞻性地收集了318名接受标准放疗的患者的临床结果数据，证实了SUVmax的预后价值。SUVmax是宫颈癌的一种预后标志物，与炎症通路的激活和骨髓衍生免疫细胞（尤其是巨噬细胞）的肿瘤浸润有关。巨噬细胞有助于宫颈癌葡萄糖代谢的变化。