全面了解代谢相关特征和分类可能会改善 LGG 的临床结果

Metabolic Signature-Based Subtypes May Pave Novel Ways for Low-Grade Glioma Prognosis and Therapy

基于代谢特征的亚型可能为低级别胶质瘤的预后和治疗铺设新的途径

发表期刊：Front Cell Dev Biol

发表日期：2021 Nov 23

DOI:  10.3389/fcell.2021.755776

一、背景

        低级别胶质瘤（LGG）是中枢神经系统肿瘤中最常见的缓慢生长的脑癌。弥漫性浸润的LGG包括星形细胞瘤、少突胶质瘤和混合型少突胶质瘤（WHO 2级）。LGG通常是非恶性的，生长缓慢，占所有成人原发性中枢神经系统肿瘤的6.4%。LGGs的特征是惰性肿瘤，生存率在1-15年之间。

        异常的细胞代谢改变了代谢和免疫微环境，并已成为癌症诊断和治疗的一个治疗目标。证据表明，代谢相关基因可能通过改变肿瘤代谢和行为或影响肿瘤微环境而促进肿瘤的发展。代谢相关基因在癌细胞中发挥关键作用，癌细胞代谢重编程被认为是未来癌症研究的新方向。

二、材料与方法

1.数据来源

1）从TCGA数据库和GDC工具中下载了LGG患者的基因转录组资料和相应的RNA-seq数据，509个LGG样本可用于分析

2）从CGGA下载了mRNA-seq 693和mRNA_seq325数据集，408个样本最终被纳入本研究

3）代谢相关的基因选择：共选择了2752个编码代谢酶和转运蛋白的代谢相关基因

2.实验流程

1）基因组数据预处理：没有临床数据和缺失超过50%的样本被剔除，得到了一个包含20485个基因谱的表达谱数据集

2）代谢亚组分类：ConsensusClusterPlus实现了共识聚类（CC）方法

3）肿瘤免疫浸润：CIBERSORT；采用ESTIMATE包来确定浸润性免疫细胞的存在，使用基于LGG RNA-seq数据的ImmuneSignature基因集

4）基因组变异分析和功能注释：GSVA

5）代谢亚型特征评分的构建：应用主成分分析（PCA）；使用113个代谢特征进行PCA分析；计算公式MRGs-分数=∑（PC1 I +PC2 I），其中I代表代谢特征。

三、实验结果

01 - 代谢相关基因的鉴定和分类

        为了确定预后相关的代谢特征，作者计算了TCGA和CGGA队列中113个来自LGG患者的代谢基因的富集分数和预后特征。结果表明，在TCGA数据库中有69个预后相关的代谢特征，73个预后相关的代谢基因（图1A）。此外，采用ConsensusClusterPlus，根据509个LGG样本的特征进行分类，并将这些特征相似的基因归为一类（图1B,C）。最后，得到了三个不同的代谢集群（MC），其特征是一致的代谢亚型相关特异性（图1D）。作者进一步调查了与这三个集群相关的预后。总生存期（OS）的结果表明，与TCGA数据集中的MC2和MC3相比，MC1预测的生存时间最短（图1E）。无进展生存期（PFS）的结果显示，在TCGA队列和CGGA队列中，MC1亚组的生存率最差（图1F,G）。

图1    LGGA的代谢亚型

02 - 低级别胶质瘤的三个代谢组的不同特征和结果

        结果表明，基于年龄或性别，任何特征的发生都没有显著差异（补充图S1A,B）。在TCGA数据库中，IDH突变存在明显的差异，MC2和MC3亚群的IDH突变明显高于MC1亚群（补充图S1C）。概率浸润加权梯度图也表明，在TCGA数据集中，1p和19q（1p/19q）染色体编码缺失状态明显高于MC2和MC1（补充图S1D）。与MC2和MC3亚组相比，MC1的甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）的表达明显下降（补充图S1E）。同时，在CGGA数据库中探讨了这些特征，与之前的观察一致，三个群组并没有基于年龄或性别的明显差异（补充图S1F,G）。与MC1相比，MC2和MC3的IDH突变和1p19q共同缺失明显较高（补充图S1H,I）。MGMT的表达在三个亚组中没有明显差异（补充图S1J）。

补充图S1

        为了彻底研究代谢特征，作者应用差异化表达分析来确定基于GSVA评分系统的亚型特定代谢特征。根据结果，47个特定的代谢特征存在于MC1，6个存在于MC2，39个存在于MC3。这些基因被应用于进一步区分代谢亚组。

        作者还分析了TCGA队列中这三种代谢亚型之间基因组变化的差异。MC3亚型表现出较低的非整倍体分数（图2A）、分数改变（图2B）、片段数量（图2C）和同源重组缺陷数量（图2D）。肿瘤突变负担在所有三个亚组中是相似的（图2E）。此外，作者还分析了基因突变和代谢亚型之间的相关性，发现代谢亚型。与基因突变有明显的相关性。TP53、IDH1、ATRX和EGFR基因在LGG中表现出广泛的体细胞突变，其中IDH1基因在MC2和MC3亚型中突变频率较高，有IDH1/2突变的肿瘤患者预后良好。ATRX基因在MC2亚型的突变频率最高，其次是MC1。EGFR在MC1亚型中的突变频率较高，但在MC2和MC3亚型中的突变频率都较低。在拷贝数变异方面，MC1亚型有广泛的拷贝数扩增和缺失频率（图2F）。

图2    TCGA队列中三个集群的基因组改变情况

03 - 代谢亚型的异质性分析

        为了全面研究不同代谢亚型之间的肿瘤异质性，作者从已知的研究中获得了包括肿瘤纯度、倍性、扩增和瘤内异质性的基因组特征。结果表示，MC1和MC3的纯度、倍性和瘤内异质性都明显低于MC2（补充图S3A-C）。MC1显示出最高的增殖得分，其次是MC2和MC3（补充图S3D）。研究表明，mRNAsi指数高的LGG患者比mRNAsi指数低的患者预后好（补充图S3E）。从数据中获得并分析了LGG患者的mRNAsi差异，发现MC2和MC3的mRNAsi指数明显高于MC1。还分析了不同代谢亚型之间基于指数的表观遗传调控（EREGmRNAsi）差异，发现EREGmRNAsi亚型之间没有明显差异（补充图S3F）。

补充图S3

04 - 代谢亚型和免疫细胞浸润的比较

        比较确定的三种代谢亚型与以往研究报告的七种代谢亚型之间的差异，作者确定Codel和G-CIMP-high在MC2和MC3亚型中较高。在MC2亚型中，Codel和G-CIMP-高的患者比例分别为35%和57%，而在MC3亚型中为55%和36%。具有Codel和G-CIMP-高的患者预后较好（图3A）。作者还将代谢亚型与之前报道的六种免疫分子亚型进行了比较，发现C3亚型的预后最好，C4和C6亚型最差。MC2和MC3亚型中C5亚型的比例分别为77%和86%，而MC1亚型中C4亚型的比例为62%，高于MC2和MC3亚型的比例（图3B）。免疫浸润分析显示，在TCGA队列中，MC1的免疫微环境浸润最高，其次是MC2，而MC3的免疫浸润得分最低（图3C）。在CGGA队列中也观察到一致的结果：MC1亚型的免疫浸润最高，明显高于MC2和MC3代谢亚型（图3D）。

        然后，应用CIBERSORT方法来研究每个代谢亚型中的免疫细胞成分。结果表明，不同亚型的免疫细胞之间存在着明显的差异（图3E、F）。此外，还应用xCell、EPIC和MCP-counter全面评估了TCGA数据库和CGGA数据集中的肿瘤浸润性免疫细胞得分。而结果表明，MC1亚型的免疫浸润最高，而MC2和MC3代谢亚型则明显低于MC1亚型。此外，大多数免疫细胞在TCGA数据库和CGGA数据库的亚型之间有明显的差异（补充图S4）。这些发现表明，代谢相关分类与免疫细胞浸润密切相关，这可能是LGG免疫评价中一个有效的评价方法。

图3    经典免疫细胞分型和免疫细胞成分分析的差异比较

05 - 代谢亚型对免疫治疗有预测价值

        为了评估代谢相关亚型的不同免疫治疗和潜在的临床效果，作者采用了TIDE软件，确定MC在TCGA队列中的TIDE得分最高，这表明MC2免疫逃逸的可能性较大，从免疫治疗中获益的可能性较低（图4A）。还比较了TCGA队列中不同分子代谢亚型之间的T细胞功能障碍得分和T细胞排斥得分的差异。结果表明，MC2亚型的T细胞功能障碍得分最低，但T细胞排斥得分最高。MC1和MC3亚型的T细胞功能障碍得分高于MC2亚型，但T细胞排斥得分较低。然而，MC1和MC3亚型的T细胞功能障碍评分和T细胞排斥评分没有明显差异（图4B，C）。在CGGA队列中也观察到类似的结果（图4E-G）。

        作者还探究了不同代谢亚型的预测免疫治疗反应的差异，结果显示MC2和MC3亚型之间的免疫治疗反应状况存在明显差异。在CGGA队列中，MC1亚型与MC2和MC3亚型之间存在明显差异（图4D,H）。进行了亚类图谱的绘制，比较了三种代谢亚型的免疫治疗数据，发现TCGA和CGGA队列中的MC1亚型对抗PD1治疗敏感，而MC3亚型对CTLA4-R敏感（图4I,J）。

图4    三个群组之间的免疫治疗反应差异

06 - 代谢亚型特征评分构建

        由于不同的代谢亚型有不同的代谢特征，作者进行了PCA来构建亚型分类特征得分从而更好地量化每个样品的代谢相关特征。PCA表明，PC1和PC2可以成功地根据TCGA数据库中的代谢亚型分类特征对LGG样本进行鉴别和分类（图5A）。结果显示，三种代谢亚型的微环境相关基因得分存在显著差异（图5B）。ROC曲线结合了敏感性和特异性，显示了不同簇的不同代谢亚型特征评分的表现。AUC为0.86，这表明该特征得分模型具有很好的预测能力（图5C）。在CGGA数据库中也有类似的特征（图5D-F）。

图5    构建代谢亚型特征得分

        为了评估代谢亚型特征分数与免疫细胞特征之间的相关性，进行了Pearson相关分析，发现代谢亚型特征分数与免疫细胞没有明显的相关性，除了M2巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。M2巨噬细胞与代谢相关的分数有明显的负相关，而嗜酸细胞与这些分数有正相关（补充图S5A）。CGGA队列中M2-巨噬细胞浸润的结果与TCGA队列的结果一致（补充图S5B）。此外，为了更好地描述代谢亚型、代谢得分和免疫检查点分子之间的相关性分析，采用了相关性分析，发现代谢亚型、代谢得分和免疫检查点分子之间有明显的相关性（补充图S6）。

补充图S5 补充图S6

07 - 代谢共表达基因模块

        为了进一步确定与共表达基因模型相关的代谢亚型，作者进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），以确定与各种基于LGG代谢特征的亚型相关的模块。在TCGA基因表达谱中，选择MAD（中位数绝对差异）超过50%的基因，进行进一步的WGCNA分析。图6显示了样本聚类情况，类似的集群被合并成新的模块，产生了18个基因分子（图6D）。每个共表达网络的18个基因编号在图6E中说明。进一步分析了每个共表达基因模块与年龄、性别、IDH1/IDH2突变状态、MGMT甲基化状态、1P/19Q CODEL状态以及MC1、MC2和MC3之间的相关性。结果显示，绿色模块与MC1的相关性最高，青色模块与MC2明显正相关，而蓝色模块与MC3明显正相关（图6F）；绿色模块与MC1有显著的相关性（图6G）；青色模块与MC2有明显的相关性（图6H）；蓝色模块与MC3有明显的相关性（图6I）。

图6    共同表达的基因模块识别

        作者计算了17个模块（不包括灰色模块）的特征向量与代谢亚型特征指数之间的相关性，如图7A所示。绿色和青色模块与代谢亚型特征得分有显著的负相关（图7B,C），蓝色模块与代谢亚型特征得分有明显的正相关（图7D）。对这三个模块的基因进行了功能富集的筛选，结果如下。如图7E-G所示，绿色模块与白细胞增殖、白细胞激活的正向调节、T细胞激活和其他免疫过程有关。KEGG途径在肠道免疫网络中富集了IgA产生和Th17细胞分化。青色模块对蛋白质靶向膜、蛋白质定位到内质网和其他过程明显富集（图7F）。此外，蓝色模块显著富集的结果显示在图7G中。

图7    代谢共表达基因模块的功能富集分析

        此外，在绿色、青色和蓝色模块中分别确定了24个、13个和21个关键基因，其相关系数大于0.9，与预后有明显关联（图8A）。用维恩图来确定总共八个关键基因的交集：BTK、ALOX5、ARPC1B、REL-10、ITGB2、GPSM3、LAPTM5和MYO1F（图8B）。根据基因表达水平，患者被分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier预后分析显示，这八个基因的高表达水平与预后不良相关（图8C）。总之，这八个基因是与代谢亚型特征评分相关的潜在标志物。

图8    代谢共表达基因模块的枢纽基因鉴定

四、结论

        本研究应用生物信息学分析来确定来自癌症基因组图谱（TCGA）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）的LGG患者的代谢特征。结果显示，LGG患者根据113种代谢特征分为3个亚型。不同的代谢亚型具有不同的代谢和免疫特征，并且可能对免疫治疗有不同的反应模式。基于代谢亚型，表现出不同的模式，反映了每种亚型的特征。综上所述，我们建立了稳定的代谢特征分类模型，并确定了LGG预后和进展的8种潜在代谢生物标志物。