25.利用分子内荧光共振能量转移（FRET）研究受体构象

7.1 前言

G蛋白偶联受体在与配体结合时会发生构象变化，并传递到细胞内表面，如异三聚体G蛋白、G蛋白偶联受体激酶或arrestin，影响受体与效应蛋白的相互作用。大量的报道表明，这些构象变化涉及受体跨膜螺旋的重排。光谱方法特别适合实时测量这种构象变化的动力学。

视紫红质是一种视觉色素，它是第一个(现在仍然是最受欢迎的)被发现的G蛋白偶联受体，就进行了光谱研究。这有两个原因。首先，视紫红质的提纯和大量制备相对容易。其次，视紫红质携带共价结合配体(11-顺-视网膜)，可通过光谱检测。从大量的研究中，已经确定了几种中间构象。简单地说，光诱导11-顺-视网膜异构化为全反式异构体。这个初始过程发生在飞秒的时间尺度上。带电的色团-视蛋白复合物至少通过另外两种状态进行：光视紫质和深视紫质。在光激活后，向深紫红质的转变在纳秒时间内发生。然后深海视紫红质松弛形成光视紫红质的过程需要几微秒。最后，形成能与G蛋白作用的视紫红质构象，即metarhodopsin I和II。这个过程以毫秒为单位进行。对其他G蛋白偶联受体构象变化的观察还没有达到同样的细节水平。这主要是因为必须人为地将荧光基团引入受体中。这一壮举首先是由Brian Kobilka小组在从Sf9细胞中纯化的人2-肾上腺素能受体上实现的。虽然他们最初标记的是天然受体，但后来通过构建只含有少量半胱氨酸和赖氨酸残基的受体，实现了更大的多功能性。半胱氨酸和赖氨酸可以在这些受体的任意位点被引入，然后用合适的探针进行化学标记。最近Kobilka对这些实验进行了综述。许多不同的实验表明，当与一个完整的激动剂结合时，例如去甲肾上腺素或异丙肾上腺素，2-肾上腺素能受体至少会经历三种不同的构象。这些变化包括:(i)螺旋6中芳香氨基酸的构象变化，由儿茶酚羟基与螺旋5中的丝氨酸残基结合而触发(称为“旋转锤”);(b)在螺旋3中，羟基与天冬氨酸反离子结合;(iii)在螺旋3下面的第二个细胞内环中，干基序内部的离子锁被打破。然而，G蛋白偶联受体的突变和纯化可能会影响其性质。因此，人们希望测量活细胞构象变化的动力学。体内蛋白质的荧光标记首先基于绿色荧光蛋白(GFP)及其光谱变体的克隆，后来随着可用于标记短肽的细胞渗透性染料而发展。最初开发的是‘荧光素砷发夹’ (FlAsH) , 然后Invitrogen开发了商用 TC FlAsH(previously Lumio Green)，后来一个 红色变体, ‘resorufin-based 砷的发夹 binder’ (ReAsH)开始商用，即TC-ReAsH(Lumio Red)。这两种染料选择性地与短肽序列CCPGCC结合。最近，有报道称一种基于cy3的双砷染料能与CCKAEAACC这一独特的肽结合。表7.1总结了G蛋白偶联受体研究中常用的一些荧光团的荧光性质；更多关于其他荧光蛋白的信息可以在其中找到。本章的目的是阐述成功创造出来的这些感受器传感器。

精心选择的探针可用于荧光共振能量转移(FRET)测量，使它能够读出两个荧光团之间的距离或方向变化。最初，我们用这种方法构建了G蛋白偶联受体，该受体携带两个荧光蛋白：一个在细胞内第三环，另一个在尾部的C端。随后，将细胞内第三环的荧光蛋白替换为FlAsH的受体肽序列。撰写本文时，该技术已成功应用于甲状旁腺激素受体、双侧2a-肾上腺素能受体、A2A腺苷受体和双侧1-肾上腺素能受体。

到目前为止，所有被研究的受体均显示激动剂结合的FRET减少(除了关于2-肾上腺素能受体的报道)，而与反激动剂结合的FRET增加。这可能是巧合。不同受体-激动剂组合的构象变化动力学不同，明显依赖于配体浓度。去甲肾上腺素激活了2 -肾上腺素能受体，其半衰期小于30ms，另一完全激动剂UK-14304也表现出类似的动力学。有趣的是，所有测试的部分激动剂在2 -肾上腺素能受体显示出更慢的半衰期：莫索尼定和多巴胺的半衰期约为70毫秒；章鱼胺、去甲肾上腺素、可乐定和奥氧美唑啉的半衰期在250 - 350 ms之间；而反激动剂育亨宾的半衰期约为1.1-1.2s。这被认为是充分激动剂、部分激动剂和反向激动剂使受体转变为不同构象的证据。腺苷活化A2A腺苷受体的半衰期约为40 ms，类似于去甲肾上腺素作用于羟-肾上腺素能受体的动力学。逆转激动剂在肾上腺素能受体的时间常数没有报道。甲状旁腺激素受体的半衰期为0.7s。

体外和原位技术都可以测量G蛋白偶联受体的构象变化。对纯化蛋白进行标记的优点是可以使用许多不同的荧光团(细胞通透性不是问题)，而且可以预测在特定位置标记的受体对配体的应用会产生怎样的反应。这些测量结果已成功地与分子模型相结合。相比之下，使用GFP变体提供很少的关于荧光团位置的空间信息，并产生关于构象变化的确切性质的信息不足。这种情况在使用FlAsH/ ReAsH后略有缓解，而且在小细胞可渗透荧光团领域的进展相当迅速，尽管在这里插入受体的受体比单侧链的突变更大。

众所周知，肾上腺素受体在几百毫秒内激活Gs，并在几秒钟内结合抑制素。这表明在原位测量的构象变化动力学与随后的信号传递过程有关。

在体外测定的构象变化动力学通常要慢得多(在几十秒的范围内)。未来的研究将必须解决这些比率如何相互关联。

7.2 方法和手段

7.2.1 为荧光基团选择合适的插入位点

到目前为止使用上述技术报道都是位于细胞内第三环和C末端尾部的FRET对。然而，细胞内第三环的长度在G蛋白偶联受体之间差别很大。因此，为了使激动剂刺激后的FRET变化最佳，必须针对每个受体结构单独优化两个荧光团的相对位置。在本章中，我们将给出一些一般性的建议，并从我们自己的经验中给出一些例子。

当使用GFP变体进行FRET测量时，需要注意的是实际的荧光团被埋在桶状结构中，与目标蛋白融合荧光基团的实际距离约15A˚。这与使用像FlAsH这样的小荧光团不同，后者直接与受体序列中编码的目标序列结合。

对于具有长C末端的G蛋白偶联受体，截断C末端可能是必要的，这样可以获得两个荧光团之间的最佳FRET。然而，如果C末端在细胞表面表达中起重要作用，那么截断可能会阻碍受体的靶向，使得构建有效的受体更加困难。对于C末端较短的受体，插入较短的连接子以提供方便的克隆位点和优化荧光团距离以获得良好的荧光信号可能有用。无论我们使用的是FlAsH/cyan荧光蛋白(CFP)还是CFP/yellow荧光蛋白(YFP)，我们都对C端使用相同的方法。

对第三个细胞内环的处理取决于使用哪种荧光团的组合。如果插入一个GFP变体，那么我们通常更喜欢使用YFP，因为它似乎比CFP更少引起受体的突变。在分辨晶体结构中，GFP的N端和C端大约在26a˚(根据对Glu6和Ile-229的羰基氧的测量)。虽然GFP的前5个N端氨基酸在晶体结构中没有被分解，但是当插入荧光团时，这个距离必须被第三个细胞内环调节。这可以通过适当的截断来实现。相反，如果使用FlAsH作为第二个荧光团，那么6个氨基酸序列(CCPGCC)足以使荧光团与目标蛋白特异性结合。荧光团的插入位点不应太靠近跨膜螺旋的末端。在视紫红质的晶体结构中，这种螺旋状结构延伸到细胞质中，比预计的要深。因此，我们假设其他G蛋白偶联受体也是如此。这种螺旋延伸被认为对G蛋白偶联很重要；因此，建议不要通过引入体积庞大的YFP或诱导转向的CCPGCC基序来干扰它。通过将细胞内第三环从Cys239到Ala357的大部分替换为YFP蛋白，可以将YFP插入到2b -肾上腺素能受体中。为了实现这一点，在去除第三个细胞内环时插入两个限制位点，然后在它们之间克隆YFP。相比之下，对于肾上腺素能受体，YFP被插入到两个相邻的氨基酸残基273和274之间。在Flash标记的腺苷A2A受体中，CCPGCC基序被插入到第三个细胞内环中自然发生的PG基序(残基217和218)周围。因此，氨基酸215、216、219和220突变为Cys。A2A受体的C端在残基340后面从122个氨基酸截断为50个氨基酸，以在受体刺激时获得良好的荧光反应信号。这些例子中荧光基团的距离为:

•2 - 2 -受体- TM5-YFP, 22个氨基酸;YFP-TM6, 17个氨基酸;
•肾上腺素能受体-TM5-YFP, 28个氨基酸;YFP-TM6, 52个氨基酸;
•腺苷A2A受体- TM5-CCPGCC, 16个氨基酸;CCPGCC-TM6,14种氨基酸。

7.2.2 膜渗透荧光双砷染料

双砷荧光团，如Flash，结合识别基序，通常必须通过诱变插入目标蛋白。该结合基序的核心序列为CCPGCC序列，可以被特异性结合。已知对双砷化合物具有较高亲和力的基序，包括特定的侧链，以及基序FLNCCPGCCMEP对FlAsH具有较高亲和力。在这里，我们将简要介绍如何通过诱变将序列插入到蛋白质序列中。

如上所述，有必要远离跨膜结构域和细胞内环的边界，以避免产生组成活性或干扰G蛋白偶联。我们使用由http://www.GPCR.org提供的关于跨膜结构域和环区域的信息来了解大多数受体。为了将CCPGCC序列引入到第三个细胞内环，我们使用了PCR技术。如果用核苷酸序列TGT TGC CCG GGC TGC TGT编码CCPGCC序列，该序列含有CCCGGG, SmaI可以将其钝端切开，XmaI可以将其与重叠片段进行重叠。通过选择特定受体和序列的引物组合，最终得到两个PCR片段和载体；因此，三段结扎将生成所需的结构，插入的SmaI/XmaI位点可用于菌落筛选。当然，这种策略只能在受体序列中没有内源性SmaI/XmaI位点的情况下使用。否则，可以使用标准的诱变技术。

对于腺苷A2a受体，CCPGCC序列是通过在细胞内第三环的内源性PG两侧各有两个半胱氨酸产生的。如果没有这样的序列存在，那么人们应该知道，CCPGCC最有可能形成发夹结构，因此，如果它取代内源性氨基酸，可以引起环路结构内的张力。如视紫红质所示，由于该序列的一部分是跨膜螺旋的延伸，细胞内的第三个小环并没有提供太多空间来容纳这个基序。如果内源性氨基酸的替换导致了受体滞留于细胞内，那么可以尝试插入整个序列，而不是用内源性氨基酸替换它。也可以插入增强的12个氨基酸基序，从而进一步减少发夹序列可能引入的张力。与6个氨基酸基序相比，这对受体来说是一个较大的变化，但在大小上仍然比荧光蛋白的变化小得多。

7.2.3 应用FlAsH进行细胞内标记

Invitrogen公司出产了FlAsH，名称是TC-FlAsH(之前是Lumio Green)。按照制造商的说明，用FlAsH灯标记细胞。由于在标记方面有许多不同的应用，因此我们简要总结了标记GPCRs的单个步骤，并对重要步骤进行评论。

对于我们所有使用super fusion系统的实验来说，有必要确保细胞贴壁。因此，细胞被接种到25毫米的玻璃盖片上，在使用前用多聚赖氨酸处理15-30分钟。大多数情况下，我们使用六孔板进行标记。这样可以确保1ml的体积足以覆盖所有的细胞，也可以用密封盖盖住培养皿，防止乙胺二硫醇(EDT)的难闻气味扩散。标记前24-48小时转染细胞。我们使用过diethylaminoethyl-dextran, 磷酸钙, Effectene和Lipofectamine等种转染。结合这种标记技术，我们还使用了多种标准细胞系，如HEK-293、HEK-TSA、cos7、HeLa和PC12，发现它们都很有用。标记前的转染时间必须单独检测，这只是一般建议。然而，细胞密度应介于60- 90%的融合度，以确保最好的标记结果。

FlAsH标记总是伴随着背景染色。这是不可避免的，但可以在很大程度上减少。但是，必须记住，局部浓度高的蛋白质，如膜定位的GPCRs，在背景标记可视化方面有很大的优势。由于EDT有一种难闻的气味，所有的标签步骤都应该在通风柜下进行。

7.2.4 配体介导FRET变化的检测

配备63或100倍的透镜的显微镜使单细胞的视觉化成为可能。用适当波长 的光源辐照细胞。与连续照明相比，闪光灯(例如Till Polychrome)可以减少光漂白。我们使用由Till光子学的光度测量系统作为探测器，它同时允许我们获得一个区域在两个波长的荧光强度。探测器配备了一个分束器，引导入射光到两个光电二极管。对于CFP/YFP，分束器是DCLP505(色度技术)。CFP光通过480± 20 nm的带通滤波器。YFP可采用535±15 nm带通滤波器或LP515长通滤波器。测光系统配备了一个取景器，在目前的版本中，可以过滤出600纳米的>光；因此，它不能用于测量更长的波长的FRET。光电二极管产生的信号用Digidata1322 (Axon Instruments, Union City, CA, USA)进行数字化，用Clampex8.1或Axioscope软件(Axon Instruments)在PC上采集。Clampex/Axioscope还控制灌注系统。或者，也可以使用照相机来检测荧光。我们将CoolsnapHQ与多光谱成像图像分配器(Optical Insights)结合使用。与测光系统相比缺点是相机的灵敏度，因此，时间分辨率较低。

对于所选配体的应用，我们使用由压缩氮气/空气驱动的灌注系统(ALA- vm8, ALA Scientific Instruments)。该系统切换时间非常短(<10 ms)。用微操作器(例如Marzh¨auser MM33)将灌注系统的尖端靠近细胞放置。

7.3 Troubleshooting

•最常遇到的问题是细胞灌注激动剂时没有变化。这通常是由于构造的一般性问题或灌注细胞的失败造成的。以上述方式构建受体，并不能保证构建的结构将显示激动剂诱导的FRET变化。例如，为了得到甲状旁腺激素受体传感器，我们制造了超过六种不同的结构，其中只有一种结构显示了激动剂引起的FRET变化。另一方面，有时我们非常幸运，因为第一个构造就显示激动剂引起的FRET变化。

•灌注系统的细管有时会堵塞。这可能是由气泡或颗粒引起的。要摆脱这些，请参阅制造商的说明。将灌注系统储存在20%的乙醇中通常可以避免阻塞。

•灌注系统的尖端必须非常靠近细胞。使用100倍的镜头，如果镜头尖端刚好在视野之外，我们可以得到很好的效果。如果尖端的位置太靠近细胞，那么细胞可能会被冲走。

•有时，会遇到不可接受的背景噪声。通过在安装显微镜&灌注系统防震台可以使之降低。

噪音也可能是溶液中 的污染物造成的, 0.22微米过滤器可以解决。

Note

最近，我们发现了人类B2缓激肽受体和鼠M1乙酰胆碱受体的构象传感器。eYFP被插入到第三个细胞内环，Cerulean连接到C端；对于B2缓激肽受体，C末端在连接Cerulean之前被截断，以增加分子内的FRET。在应用激动剂时，M1传感器是第一个显示FRET上升的传感器，而不是迄今为止观察到的所有其他传感器的下降。下表提供了所有已发表的G蛋白偶联受体构象传感器的概述。