类器官模型与应用——新手指南

类器官技术的发展为临床前治疗策略的开发开辟了崭新的途径。通过基于成体干细胞的类器官培养技术，能够获得、并且在体外条件下可以长期培养、接近生理状态的3D培养物，为基础科研和临床转化提供了一种非常灵活的工具。作为突破性前沿技术，类器官在生物医学领域的应用尽管处于起步阶段，但是已经展示出的潜力和价值使科研人员对这一技术的发展和未来的应用充满期待。本文将简要介绍类器官技术的模型构建和应用方向，希望能够为对这一前沿技术感兴趣的老师提供参考。

什么是类器官模型？

类器官（Organoids）是由干细胞在特定的体外培养条件下，通过自组织发育而来的能够模拟体内器官结构和功能的三维结构，包括了多种细胞类型。

类器官技术方面的突破发生在2009年，荷兰乌得勒支大学医学中心Hans Clevers实验室率先发现成年小肠中存在的干细胞可以在体外增殖，并自组织成类器官[1]。

与传统的二维细胞培养相比，类器官具有许多优势。例如，类器官能够展示接近生理状态的细胞组成和生理功能，许多类器官可以在培养过程中经历多次增殖传代并维持基因组稳定性，具有这些特征的模型特别适合用来作为生物样本库和高通量筛选。与动物模型相比，类器官模型可以降低实验的复杂性，并且能够应用实时影像技术。而且更重要的是，动物模型很难或不能精确模拟人类发育和疾病的研究，而类器官模型却可以做到这一点。

如何构建类器官模型？

类器官技术的关键是获得成体干细胞，然后在合适的培养条件下，重建来源组织的结构和功能。类器官培养体系是构建干细胞发育成具有特定结构和功能的组织所需要的微环境。

类器官可以用来自手术切除的实体样本或穿刺样本进行构建。对于实体组织，第一步是尽可能去除肌肉和脂肪等非上皮组织。然后，将原代组织用手术刀切割成小块，再用酶来进行消化，从而将组织解离成单细胞悬液。下一步将单细胞悬液种植在3D细胞外基质水凝胶上，如基底膜提取物（BME）、Matrigel或Geltrex。种植之后，需要加入包含生长因子的培养基来触发干细胞的再生响应。不同组织来源的类器官培养过程中需要的培养基成分是有差异的。

图1  类器官的构建过程[2]

构建类器官模型之后，如何进行评价？

在构建类器官模型之后，需要通过一些方法，来比较构建的类器官和生理组织之间的相似性。例如，在构建小鼠肠道类器官模型之后，作者通过免疫荧光染色、免疫组化、电子显微镜照片等手段检测了类器官中是否包含了肠道隐窝结构中常见的细胞类型，例如肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、以及肠内分泌细胞。由此，可以说明构建的肠道类器官能够重现正常肠道组织包括的细胞多样性。

图2  类器官模型的评价[1]

类器官模型可以应用在哪些研究方向？

在很大程度上，类器官应该被视为一种目前正在快速发展中的模型系统，这一技术已经在许多领域已经展示出巨大的发展潜力。下面介绍一些类器官已经崭露头角的应用领域。

（1）建立生物样本库。例如，近期一项研究建立了胃癌的生物样本库。胃癌是一种异质性的疾病，其特点是包括多种组织和分子亚型，例如微卫星不稳定（microsatellite instability, MSI）、EB病毒、肠染色体不稳定（CIN）、弥散型等。肿瘤类器官的生物样本库作为一种体外细胞模型，利用测序技术可以获得非常接近体内肿瘤细胞的基因组特征，通过结合基因组测序数据和组织形态可以鉴定出各类肿瘤亚型。

图3  胃癌类器官样本库[3]

（2）研究疾病发生的机制。例如，分别取正常组织、溃疡性结肠炎非炎症区域与炎症区域的组织、以及结肠炎相关肿瘤组织来构建类器官模型，通过对单克隆类器官的全外显子测序和靶向测序，揭示了溃疡性结肠炎发病过程中积累的体细胞突变。

图4  利用单克隆类器官研究体细胞突变[4]

（3）预测药物敏感性。将从病人获取的肿瘤组织构建类器官模型之后，用治疗肿瘤的药物进行处理，可以预测特定病人的肿瘤对药物是否敏感。通过类器官模型对药物处理的响应可以指导临床用药。

图5  利用从病人获得的类器官进行药物敏感性测试[2]

（4）再生医学与器官修复。小肠是吸收营养的主要器官，大规模切除小肠会导致短肠综合征（short bowel syndrome，SBS），这是一种严重的吸收障碍，以腹泻、脱水和体质量减轻为特征。近期一项研究将构建的人回肠类器官移植到短肠综合征大鼠模型中，移植后的类器官能够生成一个高度血管化且具备功能的小肠化结肠，不仅包含脉管系统和神经支配、绒毛结构和乳糜管在内的完整的小肠结构，而且具有吸收胆固醇的生理功能。

图6  利用回肠类器官对大鼠短肠综合征疾病模型进行治疗[5]