Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune-dysfunction in pancreatic cancer

空间分辨多组学单细胞分析揭示胰腺癌免疫功能障碍的机制

背景部分

• Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)

  • very aggressive malignant disease
  • extremely poor prognosis ==> complex and dense microenvironment.
  • largely resistant to immunotherapy
    • relatively few coding mutations
    • few neo-antigenic targets embedded in an “immunologically cold” TME with a dominant immunosuppressive myeloid infiltrate ==> impedes intratumoral CD8+ T cell infiltration and activation
  • PDAC的恶性源于其复杂且密集（dense）的肿瘤微环境。PDCA一方面编码突变较少，另一方面这种微环境相对来说是一种冷免疫状态，然后有免疫抑制性的髓系细胞浸润，导致肿瘤内CD8+ T细胞浸润和激活减少。

• Early oncogenesis

  • oncogenic driver ==> accumulation of immune and stroma cell components in the tumor microenvironment (TME) ==> immunosuppressive niche that shapes cancer cell states supporting tumor progression

• 尽管最近的里程碑式研究为PDAC中上皮、基质和免疫区室的复杂性提供了重要的见解

• 对于肿瘤浸润免疫细胞群，特别是CD4 T细胞和B细胞的亚型和转录状态，以及特定的肿瘤相关免疫表型，仍知之甚少。

• 缺乏相邻正常胰腺组织对照。

目标

• To further advance the design of immunotherapeutic strategies in PDAC by an improved
  understanding of the unique tumor-related immune landscape.
• 为了通过更好地了解独特的肿瘤相关免疫景观，进一步推进PDAC免疫治疗策略的设计
• scRNA + CyTOF + 空转 + mfIHC
• Our data corroborate and further extend previous single-cell analyses of the TME in PDAC, providing a spatially-resolved fine map of the immune ecosystem in PDAC and a comprehensive resource for future functional studies and the exploration of therapeutic strategies in this disease.
• 我们的数据证实并进一步扩展了先前对PDAC中TME的单细胞分析，提供了PDAC中免疫生态系统的空间分辨精细图谱，为未来的功能研究和探索该疾病的治疗策略提供了全面的资源。

扩展认知，精细描绘

Result

A single cell map of the immune microenvironment in human PDAC

人类PDAC免疫微环境的单细胞图谱

我觉得都这儿就是描绘了一下肿瘤内细胞的一个分布情况。

单细胞测序
细胞间存在明确界限：

• immune (CD45+,PTPRC)epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM)

• stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)

• 材料：9例原发PDCA做单细胞测序，瘤VS瘤旁

• 用流式分选出足够的EpCAM- CD45+细胞，然后做单细胞测序，其中3个病人还做了CD45-的单细胞测序。

空转

• 材料：病理切片
• 做多重免疫荧光加空转

细胞学

• CyTOF和FACS分析白细胞组分
• 患者术前血样中获得的PBMC

免疫学评估

• 应用mfIHC评估了30名患者的外科切除标本中的免疫亚型，并根据TCGA和ICGC数据库中未接受治疗的PDAC患者队列验证了结果。

结果

• 19229 tumor cell / 3744 non-tumor cell
• 20,000 read pairs per cell

• 无监督聚类 + UMAP降维：12个聚类（大部分聚类在9个患者中都有，且是PDAC和相邻组织共有）

  
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进一步验证

• scRNAseq鉴定的主要免疫亚群，应用多重IHC验证：肿瘤组织中CD4 T细胞、Tregs和ur巨噬细胞的显著富集。

  
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• 进一步分析TME内所有主要细胞类型的相邻情况，及其与肿瘤（这儿感觉是边界）的接近程度（图1D-F）

• 表明肿瘤免疫细胞的相互作用在空间上受到限制，只有成纤维细胞和树突状细胞（DC细胞）聚集在肿瘤边界

  
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CD8 T and NKT cell function is dysregulated in the tumor microenvironment in PDAC

PDAC肿瘤微环境中CD8+ T细胞和NKT细胞功能失调

这儿为了进一步分析CD8+ T细胞的情况。

聚焦分析CD8+ T细胞

• 进一步分析CD8+ T细胞的亚群情况，肿瘤和相邻非肿瘤样本共有6个定义明确的亚群（图2A，B）。
• 表达多种抑制性受体的
  • 初始CD8 T细胞（Naive CD8）
  • 耗竭的CD8 T（CD8-Tex）细胞
• 根据GZMK、GNLY和IFNG的差异表达鉴定了三组CD8 T效应细胞（CD8-Teff）
  • CD8-Teff-GZMK
  • CD8-Teff-GNLY
  • CD8-Teff-IFNG

• 还一组CD8组织驻留记忆（CD8 tissue-resident memory，CD8-Trm）

  
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GZMK 分子靶点综述
颗粒酶是丝氨酸蛋白酶，由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞释放的胞质颗粒所分泌。颗粒酶可诱导病毒感染细胞的凋亡，从而杀死它们。人的颗粒酶包括颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、颗粒酶K和颗粒酶M
GNLY：编码颗粒溶素的基因 同用名: LAG2; NKG5; LAG-2; D2S69E; TLA519
颗粒溶素（英语：Granulysin，又译为“颗粒溶解素”）
该基因的产物是类皂苷蛋白 (SAPLIP) 家族的成员，位于 T 细胞的细胞毒性颗粒中，在抗原刺激时释放。这种蛋白质存在于细胞毒性 T 淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性颗粒中，对结核分枝杆菌和其他生物体具有抗菌活性。已经鉴定出编码不同亚型的选择性剪接转录物变体。
GZMB 分子靶点综述
颗粒酶B(GranzymeB)是一种丝氨酸蛋白酶，最常见于细胞毒性淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤细胞(NK细胞)颗粒中。由这些细胞分泌的GranzymeB和穿孔蛋白一起作用介导靶细胞的凋亡。最近，人们发现许多非细胞毒性细胞从嗜碱性粒细胞、肥大细胞到平滑肌细胞也可产生GranzymeB。GranzymeB通过刺激细胞因子的释放参与诱导炎症，同样也参与细胞外基质重塑。升高的GranzymeB水平与许多自身免疫性疾病、一些皮肤病和1型糖尿病有关。
IFNG 分子靶点综述
IFN-γ主要由Th1型细胞产生，属于II型细胞因子中干扰素家族中的一员，是一类分泌型糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量是16942。IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生，具有调节机体免疫状态，介导细胞免疫，加强受体介导的吞噬功能，增强巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤活性，具有抗病毒感染及抗肿瘤等生物学活性。
PRF1（穿孔素 1）功能概要
该基因编码的蛋白质与在免疫中很重要的补体成分 C9 具有结构相似性。这种蛋白质形成膜孔，允许释放颗粒酶和随后的靶细胞细胞溶解。孔的形成是发生在靶细胞的质膜中还是发生在靶细胞内的内体膜中尚有争议。该基因的突变与多种人类疾病相关，包括糖尿病、多发性硬化症、淋巴瘤、自身免疫性淋巴组织增生综合征 (ALPS) 、再生障碍性贫血和家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症 2 型 (FHL2) ，这是一种罕见且致命的儿童早期常染色体隐性遗传病.

观察结果，non Tumor vs Tumor

• 与邻近的正常组织相比，CD 8-Teff-GZMK和CD 8-Teff-GNLY细胞在肿瘤中的丰度显著降低（补充图2B）。

  
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细胞层面差异基因分析

• CD8-Teff簇的差异基因表达分析显示，CD8-Teff-GNLY细胞在整个Teff簇中表达相对较高水平的细胞毒性模块（补充图CD），这些模块在肿瘤浸润的CD 8-Teff细胞群中显著下调（前文图C和补充图E-G）
• 注： 这儿的GZMB，PRF1，GLNY都在瘤内低表达，三种肿瘤中都是这样的。
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这种T细胞分群存在什么样的进化趋势？

• 进化轨迹分析。

• 初始CD8 T细胞位于轨迹路径的开始，CD8-Tex、CD8-Teff-IFNG和CD8-Teff-GZMK细胞大多位于末端状态（图2D）。

• 注： Tex往T1方向走，IFHG和GZMK往另一个方向。
  

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• 沿着这两个轨迹，衰竭和免疫功能障碍的信号被上调，而幼稚和细胞毒性的信号被下调（这个和前文PDAC里面细胞毒性模块下调我理解是一致的），这表明PDAC中的CD8 T细胞逐渐获得衰竭和功能障碍的表型。（H-T1；I-T2）

  
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验证

• 通多重免疫荧光，进一步验证了PDAC TME中有CD8 Tex的存在（表达各种抑制性受体）（2E）。我们进一步分析了CD8 T细胞的空间分布，特别是穿孔素表达标记的细胞毒性亚群（PRF1？）。
• PRF1+ CD8+ T细胞几乎不存在于PDAC TME内，并且倾向于在肿瘤边缘处、接近CD163+的巨噬细胞周围略微富集
• F：肿瘤组织的7-Panel多重IHC。放大区域显示箭头标记的PRF1+CD8+T细胞。
• G、H：PDAC里大部分是PRF1-的，边界外PRF1+明显增多。

• I：不同种类细胞间的相对距离。

  
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PDAC & LUAD

• 评估两类肿瘤的浸润性T细胞的频率和转录状态。
• LUAD中没找到CD8+ Trm（图J）
• LUAD中，CD8+ Teff具有更高水平的PRF1和GZMB，说明有更高的细胞毒性潜力，同时PDCD1和CTLA4水平更高。
• 注： 这儿感觉可以说明这种肿瘤的免疫治疗效果会比较好？

程序性细胞死亡蛋白 1 (PDCD1) （其实就是PD-1）
是一种在活化 T 细胞中表达的免疫抑制受体；它参与 T 细胞功能的调节，包括效应 CD8+ T 细胞的功能。此外，该蛋白还能促进 CD4+ T 细胞分化为 T 调节细胞。 PDCD1 在包括黑色素瘤在内的多种肿瘤中表达，并已证明在抗肿瘤免疫中发挥作用。此外，这种蛋白质已被证明参与了自身免疫的防御，然而，它也有助于抑制有效的抗肿瘤和抗微生物免疫。
CTLA4 分子靶点综述
细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4)，又名 CD152，是免疫球蛋白超家族中的成员，在辅助型 T 细胞表面表达。 CTLA-4 类似于 T 细胞的共刺激蛋白 CD28，它们都结合 CD80 和 CD86。CTLA-4 传递抑制信号给 T 细胞，而 CD28 则传 递刺激信号。CTLA-4 可作为免疫检查点发挥功能、下调免疫系统、当结合抗原递呈细胞表面的 CD80 或 CD86 时作为“关 闭”开关。细胞内的 CTLA-4 同样存在于调节性 T 细胞中，对它们的功能发挥是重要的。该基因突变与胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺机能亢进、桥本甲状腺炎、乳糜泻、系统性红斑狼疮、甲状腺相关眼病、 原发性胆汁性肝硬化和其它自身免疫性疾病有关。CTLA-4 基因的多态性与自身免疫性疾病如自身免疫性甲状腺疾病和多 发性硬化症有关，但这种关联性通常较弱。在系统性红斑狼疮中，人们发现可溶性 CTLA-4 的剪接变异体异常产生，且存 在于患有该病的患者血清中。

聚焦NKT

• 基于scRNAseq进一步鉴定NKT细胞（也是细胞毒细胞）（图1B，补充图1B）。
• mfIHC证实non-tumor和tumor区域均存在CD3+ CD56+ 细胞（NK细胞的marker、图3A）。
• 与CD8-Teff细胞类似，NKT细胞具有更高的细胞毒性潜力，其特征是在邻近的非肿瘤组织中GZMB、GNLY和PRF1的表达更高，而在肿瘤部位，免疫抑制分子的表达升高（图3B）。

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT) 是一种在淋巴细胞上表达的抑制性受体，最近作为癌症免疫治疗的主要新兴靶点受到广泛关注。
CCL5 分子靶点综述
趋化因子配体5(CCL5)，又名RANTES，是一种趋化细胞因子。它可趋化T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，在招募白细胞到炎症位点发挥着积极的作用。在T细胞释放的细胞因子如IL-2和IFN-γ的帮助下，CCL5可诱导某些自然杀伤细胞(NK)增殖和活化形成CC趋化因子活化的杀伤(CHAK)细胞。CCL5也是一种由CD8+T细胞释放的HIV抑制因子。最近，研究者正在开发完善乳酸菌体内产生CCL5的方案，以期其成为抑制HIV进入的局部杀菌剂。

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TME中的NKT不成熟
有趣的是，IRF8，一种已知对NK细胞功能成熟至关重要的转录因子，在非肿瘤区域的NKT细胞中表达水平更高（图3C），表明在TME中，NKT细胞在功能上仍不成熟。

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全身循环中NKT的情况

• 流式显示：外周NKT细胞表现出更强大的细胞毒性前表型，具有更高的穿孔素表达和更高的细胞毒性活性，这在肿瘤浸润的NKT细胞中几乎完全减弱（D、E）。

  
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• 此外，肿瘤浸润的NKT细胞表现出：

• 异常耗竭的表型（共表达TIM3、LAG3和CTLA4，图F）

• 主要调节表型为CD4、IL-4和IL-13（图G）。

  
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肿瘤细胞的一个空间情况

• NKT细胞倾向于在肿瘤边界富集（图3H，I）

  
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• 小背景： 导管/肿瘤细胞和NKT细胞之间的许多免疫调节相互作用是通过配体-受体分析来推断的。这儿包括：

  • MIF / CD74（促进肿瘤免疫逃避）
  • NKG2A / HLA-E（损害NKT细胞的细胞毒性活性并限制抗肿瘤免疫反应）

• 以上这些interaction在不用细胞类型中都有出现，感觉就是可以促进肿瘤的恶性表型（图3J）。

• 而且，与CRC、GC和LUAD的NKT细胞相比，PDAC中效应分子的表达尤其受损（图3K）。

  
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Tumor-infiltrating CD4 T cells have an exceptionally dysfunctional phenotype in pancreatic cancer

肿瘤滤过性CD4 T细胞在癌症中具有异常的功能异常表型

注： 前文讲了中的免疫图景，讲了CD 8和NKT，现在开始讲CD 4了？

FNG 分子靶点综述
IFN-γ主要由Th1型细胞产生，属于II型细胞因子中干扰素家族中的一员，是一类分泌型糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量是16942。IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生，具有调节机体免疫状态，介导细胞免疫，加强受体介导的吞噬功能，增强巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤活性，具有抗病毒感染及抗肿瘤等生物学活性。

• 先是找了单细胞做聚类，这次基于已知的marker特征聚出六类。（图A-C）
  • naive CD 4
  • 激活的 CD 4 T细胞（CD 4 Tact-IFGN、TNF、TNFSF9）
  • 记忆性 CD 4 T细胞（CD 4 Tmem-IL7R、CD40LG、LTB、KLF2）
  • Treg（FOXP3、IL2RA14）
  • 两种CD 4 T细胞耗竭的pattern（图C）
    • CD 4 Tex（PDCD1、TIGHT、CTLA4、CXCL13）
    • CD 4 CD52（CD52、RORA、（肿瘤部位CCL2、CCL5、CCL20也高））（引导Tregs和巨噬细胞进入TME）

一些观察结果

• 在PDAC中，初始CD4 T细胞大多进展为Treg和CD4CD52亚型（图D）
• 肿瘤与瘤旁的分布情况（图E、F）
  • CD4-Tex簇几乎完全来自肿瘤样本的。
  • Tregs、CD4-Tact-IFNG、CD4-Tmem在肿瘤部位积聚

  • 而CD4CD52细胞在相邻的非肿瘤区域内相对丰富

    
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验证

• mfIHC分析证实了TME中存在耗尽的CD4 T和Treg表型（图G）

  
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• TIGIT表达标记的CD4 T细胞在肿瘤附近和内部显示出更高的丰度

  
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• 针对PDAC和PBMC进行CyTOP：

  • Treg在肿瘤部位积聚

  • 而全身水平上的CD 4 T细胞扩增主要为CD 4 Tmem

    
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• 注： PDAC的TME中的细胞介导了免疫抑制。

PDAC vs LUAD

• CD 4 CD 52 T细胞簇在LUAD中完全不存在
• CD 4-Tex细胞相对更丰富
• 在PDAC和LUAD中观察到Tregs的相对丰度相似，但在PDAC中Tregs显示出显著更高的抑制性受体表达（图J）

• 类似地，PDAC中的CD4-Tex细胞表达更高水平的抑制性受体TIGIT（图K）。

  
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B lymphocytes in the pancreatic cancer microenvironment exhibit a regulatory, immunosuppressive phenotype

胰腺癌症微环境中的B淋巴细胞表现出调节性免疫抑制表型

注： 接着做B细胞

整体分布
B细胞似乎分散在整个PDAC TME中，但在肿瘤上皮细胞附近减少（图E）。

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分类

• 聚类，基于marker分成4类

• MS4A1/CD 20低表达，SDC1/CD138 高表达

• MS4A1/CD 20高表达的B细胞

  • 进一步基于转录表达聚类：
  • naive B
  • class-switched memory B

  • plasmablast B（和浆母细胞表达谱一致）

    
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• 尽管所有3个B细胞亚群都存在于正常邻近组织和肿瘤组织中，但肿瘤浸润的原始和记忆B细胞表达的TGFB1水平升高。

  
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分析细胞间作用情况

• 细胞邻近度分析：B细胞和T细胞以及巨噬细胞之间的物理距离略短（图1里面的）。

  
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• 基于scRNAseq进行细胞间通讯分析：表达TGFB1的B细胞倾向于与CD8 T细胞和巨噬细胞相互作用（图C）

• PDAC和LUAD中B细胞的单细胞转录组的比较显示

  • LUAD中幼稚B细胞的频率显著更高，而记忆B细胞和浆母细胞在PDAC中相对更丰富（图D）

  • PDAC中肿瘤浸润的幼稚B细胞表达显著更高水平的TGFB1 Pr（图E）

    
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Myeloid cells in the PDAC TME are largely skewed towards tumor-promoting subsets

PDAC TME中的髓细胞在很大程度上偏向于肿瘤促进亚群

注： 接着做髓系细胞

分类

• 聚类，基于canonical markers分成4类
  • C1Q macrophages
  • MARCO macrophages
  • CD14+ monocytes
  • CD16+ monocytes

MARCO是巨噬细胞表面的一种清道夫受体（scavenger receptor，SR）。. SR受体家族包含许多受体，大量的研究集中在心血管疾病中SR受体的模式识别功能，而对癌症中的SR受体的作用知之甚少。. 此前已有研究表明，在实体瘤小鼠模型中，使用MARCO抗体可以逆转TAM的免疫抑制作用，并减少肿瘤的进展。

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• 所有4个亚类都可以在肿瘤和邻近的正常组织中鉴定
• 经典的CD14+ 单核细胞在TME中相对更丰富

• C1Q巨噬细胞在邻近的正常细胞中富集。

  
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验证巨噬细胞

• mfIHC验证了肿瘤和邻近正常区域中存在两种表型不同的巨噬细胞亚群（图D）。

• 进一步去比较这两种亚群（图E）

  • C1Q亚群表达了更高水平的参与抗原呈递和共刺激的基因
  • MARCO巨噬细胞的特征是维持肿瘤促进微环境的基因表达更高

• 基因集富集分析（GSEA）证实了这一点（图F）。

  
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验证单核细胞

• PDAC浸润的CD14+单核细胞群体表达高水平的参与血管生成和免疫调节的基因，表明其对肿瘤的促进作用

• 而不太丰富的非经典CD16+单核细胞显示出促炎表型

  
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PDAC vs LUAD

• 单核细胞的相对比例在PDAC和LUAD之间具有可比性
  

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• 在PDAC TME中，C1Q和MARCO巨噬细胞以相等的比例存在，但在LUAD中，巨噬细胞主要为C1Q型（图H，是不是说明验证更明显）

• 在PDAC的MARCO巨噬细胞中，与免疫抑制细胞类型募集相关的趋化因子（CCL2、CCL20）的表达显著更高（图I）

  
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Tumor-infiltrating dendritic cells in PDAC have a dysfunctional phenotype with traits of impaired cross-presentation capability

PDAC中的肿瘤浸润性树突状细胞具有功能失调的表型，其交叉呈递能力受损

注： 接着做DC细胞，快做完了呜呜呜呜。

分类

• 聚类，基于常用标记分成5类
• 两个传统DC（在瘤内均较低）
  • cCD1
  • cCD2（主要）
• 在TME中发现了三个额外的DC群体。
  • 一组活化的DC，共预表达与DC成熟和免疫调节相关的基因，类似于其他实体癌中富含免疫调节分子（mregDCs）的成熟DCs，（也表达IDO1、LGALS9、IL6和STAT3，可能减弱T细胞活化和细胞毒性）
  • 一簇潜在的单核细胞衍生的DC（MoDC）（高表达的促炎细胞因子）

  • 一组浆细胞样DC（pDC），（高表达ICOSLG和TGFB1）

    
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验证

• mfIHC分析证实了PDAC TME中，cDC2是最丰富的DC群体

  
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PDAC vs LUAD

• PDAC和LUAD之间的DC亚群比例相似
• 但在PDAC中
  • cDC1表达的抗原交叉呈递相关基因（HLA-A、HLA-C、TAP2和PSMB9）水平显著较低
  • CCL17和IL8水平较高：可能促进Treg迁移和血管生成。

• 在LUAD中，cDC1表达高水平的CXCL9（可能与CD8 T细胞募集到TME中有关）

  
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The spatial composition of the immune microenvironment in PDAC and its interrelation with regional epithelial transcriptional states

PDAC免疫微环境的空间组成及其与区域上皮转录状态的相关性

注： 终于到我心心念念的空转力！好读完感觉是集中吐槽的一个Section

小目标

为了进一步研究PDAC中免疫细胞亚型的空间分布及其与恶性上皮细胞的关系，我们对组织切片进行了空间转录组学研究。

分析图像

• 在PDCA样本上标注肿瘤、肿瘤-基质界面和周围基质，并在spot阵中进行可视化（图A）。
• 已知在许多癌症类型中起作用的基因在肿瘤区域过度表达（图B）

• 饼图用于显示每个点的单个细胞类型的分布（图C）。

  
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注： 这儿想说几句，这个区域肿瘤实在是太小了，小的离谱。其次直接把单细胞那么多个类都map过来，出来的结果就很搞，这个就花的不谈，根本感觉看不出太多有用的信息。不知道一共做了几张空转，如果就这一张，感觉没啥意思。

瘤内异质性

• 对不同病理注释区域中免疫细胞亚型相对比例的量化表现出明显的瘤内异质性
• 肿瘤区域的原始CD8、CD8-Trm、cDC1、cDC2、单核细胞衍生的DC、NK细胞、C1Q巨噬细胞以及肥大细胞显著减少（图D）

cell-cell 交互

• 进一步关注细胞-细胞相互作用，作者分析了TME中参与免疫反应的配体-受体对
• 这阐述了一个抑制T和NK细胞活性以及免疫逃避的环境（图7E，F）。
  • LAG3与MHC II类复合物的基因共表达，这表明抗原呈递与免疫检查点共同调节，抑制CD4 T细胞活化。
  • T和NK细胞上TIGIT的表达与其配体PVR和PVRL2在髓系和上皮细胞上的表达相关，从而潜在地诱导T细胞和NK细胞中的调节性、非细胞毒性特征

  • 图F示例性地说明了HAVCR2/TIM3和LGALS9的表达水平的相关性（抑制T细胞活化和细胞毒性）

    
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Composition of the immune microenvironment and its association with PDAC patient prognosis

免疫微环境的组成及其与PDAC患者预后的关系

目的和干了啥

• 为了系统地绘制肿瘤浸润性免疫亚型的组成差异及其对患者生存的影响
• 30名PDAC患者，15生存期短，15长期生存，没有新辅的情况下切除术
• 应用mfIHC

结果：生存

• 根据scRNAseq分析确定的免疫抑制表型
• 在短期生存队列中，B细胞（CD20+）、NKT细胞（CD3+CD56+）、NK细胞（CD56+）和选择性活化巨噬细胞（CD68+CD163+）的比例显著更高
• 在长期存活者中，CD4 T、CD8 T和moDC（CD11C+BDCA1+CD1A+）显示出显著更高的丰度

结果：免疫细胞

• 进一步研究f免疫表型与肿瘤分级的潜在关联
• CD8 T细胞在G2肿瘤中比G3肿瘤中相对更丰富

进一步验证mfIHC结果（这儿就是上公共数据看看生存合不合前面的marker相符）

• 使用TCGA/ICGC数据集（有免疫表达特征相关资料），并建立了108名治疗前无症状PDAC患者的队列。
• CIBERSORTx用于预测细胞类型，患者根据TME中免疫细胞亚型的水平进行分层。
• Kaplan-Meier生存分析，比较了每种细胞类型的低与高标志性评分的组
  • 结果显示，较高的B、NKT、IL-4+ NKT和选择性激活的巨噬细胞标志与较短的总生存期显著相关
  • 而较高的CD3 T（不包括Tregs和NKT细胞）、CD4 T，CD8 T和CD8 Teff GNLY细胞与较长的生存期相关

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• 由于肿瘤促进或肿瘤抑制微环境的形成依赖于多个免疫亚群的协调，我们假设肿瘤浸润免疫亚群不同的模式可能是某些预后亚群的特征。
• 单变量分析确定了各种免疫亚型的组合关联，这些关联与患者生存率相关。进一步确定了两个复合免疫特征，将PDAC患者明确划分为预后亚组。
• CD8 T high、CD4 T high、选择性活化巨噬细胞 low 的肿瘤总生存更长（图B）

• PDAC TME中CD 8 high、B cell low、MARCO巨噬细胞 low总生存更好（图C）

  
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