基于无缝克隆技术构建基因敲除载体

In-Fusion无缝克隆的原理：基于插入片段和线性化载体末端15-20 bp的同源序列进行同源重组从而实现克隆的方法。

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ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpress®II 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 Exnase®II。使用任意方式将载体进行线性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物 5’ 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物 5’ 和 3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase®II 重组酶的催化下，仅需反应 30 min 即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达 95% 以上。

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一、无缝克隆实验步骤

⑴ 线性化载体的制备
通过限制性核酸内切酶酶切载体使其线性化。
⑵ 插入片段的获得：
将线性化载体末端15 - 20 bp序列作为同源序列(蓝色和红色标记)，并将其分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对引物扩增得到带有同源序列的插入片段。
⑶ 重组反应：
将线性化载体和插入片段按比例混合，在重组酶Exnase 催化下，37℃反应30min即可完成重组反应，实现两线性化DNA的体外环化。
⑷ 转化感受态细胞：
重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。

二、无缝克隆实验的示意图

基因敲除载体的构建流程.png 同源重组原理.png
思维导图.png

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Reference:
C112 CloneExpress Ⅱ One Step Cloning Kit