2021-08-24 巧改CRISPR Screening——s

  Loss of function和gain of function是基因功能研究的最重要手段。传统上，我们仅针对一个或者几个基因进行操作，以达到基因功能缺失或者获得的目的。更大规模地批量进行基因操作与功能分析是靶向筛选目标基因的更有效手段。RNAi Screening就是一种专门用于基因功能缺失的大规模功能筛选策略；而随着CRISPR/Cas9的发展，基于Cas9以及CRISPRi和CRISPRa的筛选策略也被开发出来，并广泛用于耐药基因筛选，功能基因研究等。以针对基因的敲除的CRISPR Screening为例，可以针对全基因组所有基因进行sgRNA的设计，从而进行基因敲除。理想情况下，每一个细胞中只有一种sgRNA整合进基因组并发挥功能，如果有2万个细胞，那么可以同时实现对2万个基因的敲除，结合药物筛选后者细胞表型选择，可以获得表型优势的细胞，然后将整合的sgRNA扩增并进行高通量测序，通过分析sgRNA序列即可判断对应的敲除基因；再结合表型优势细胞中sgRNA的富集程度，即可以筛选到促进和抑制相应表型的基因。换而言之，敲除后促进表型的基因，其sgRNA在细胞中将得到富集；反之，敲除后抑制细胞表型的基因，其sgRNA在细胞中将被“丢失”。

CRISPR Screening

  以上是常规CRISPR Screening的方法，而为了避免“搭车效应”，即避免一个细胞中因同时出现多种基因敲除而互相干扰对其功能的现象，通常在进行sgRNA慢病毒感染时，会使用低感染复数（MOI）的病毒进行细胞感染，以保证每个细胞中最多进入一个sgRNA慢病毒。但是这种策略同时也存在一定的问题：需要大量的细胞和多次生物学重复以获得可靠的结果。这对于一些细胞来源受限的研究是一个比较大的障碍。今天分析的这项研究则可以使用高MOI，少细胞，少生物学重复进行研究，其策略是针对相同的sgRNA引入不同的分子条码（Internal Barcode，iBar）。例如，一条sgRNA，表示4种不同的iBar，那么一次实验就相当于进行四次生物学重复实验。

iBar

Reference
Zhu, S. et al. Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens. Genome Biol 20, 20 (2019).