易基因｜一文读懂：八大RNA m⁶A甲基化研究核心问题
近年来，RNA m6A甲基化作为国家自然科学基金表观遗传学研究的热门领域，相关研究产出呈爆炸式增长，高分文章不断。本期，易基因通过对什么是RNA甲基化、m6A甲基化是否可逆、m6A甲基化的识别、m6A甲基化修饰的功能、m6A甲基化的主要研究方向、m6A甲基化检测技术工具的选择、m6A甲基化数据挖掘思路、m6A甲基化下游实验设计等八大核心问题进行总结，让您一问读懂m6A甲基化。
1、什么是RNA甲基化
RNA上修饰的种类很多，包括甲基化、羟甲基化、乙酰化等。m6A是RNA上最丰富的一种修饰，平均每条转录本有1~3个m6A修饰。m6A存在于大多数真核生物（包括哺乳动物、昆虫、植物和酵母）和一些病毒的mRNA中，也存在于tRNA、rRNA、小核RNA（small nuclear RNA, snRNA）以及一些长链非编码RNA。m6A甲基化（N6-methyladenosine）是指RNA分子在RNA甲基化转移酶复合体（MTC）的作用下将甲基选择性地添加到特定腺嘌呤碱基上的过程。
2、m6A甲基化是否可逆？
m6A甲基化是动态可逆的。
m6A的添加（Writers）：通过m6A甲基转移酶复合体，主要识别CDS和3’ UTR中的RRACH基序并进行修饰。（ R = G or A；H = A,C, or U）
m6A的去除（Erasers）：FTO与ALKBH5
m6A甲基转移酶复合体的组成
3、m6A甲基化的识别
m6A的识别蛋白（Readers）：m6A可以通过招募各种识别蛋白的结合，以决定RNA的命运，从而调控细胞的功能状态。
直接识别蛋白：以色氨酸口袋进行m6A识别
m6A结构开关（m6A structural switch）：RNA获得m6A修饰之后二级结构打开，让识别蛋白能够识别
间接识别蛋白：通过直接结合识别蛋白，从而影响RNA的功能
4、m6A甲基化修饰的功能
m6A识别蛋白介导了m6A修饰对RNA的各种功能，m6A甲基化通过基因转录后调控，参与细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、环境应激和各种疾病的发生发展。
细胞核内识别：介导可变剪接、RNA成熟、RNA出核
细胞质中识别：介导RNA翻译、RNA降解、RNA稳定性
5、m6A甲基化的主要研究方向
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究。
6、m6A甲基化检测技术工具的选择
MeRIP-seq和微量MeRIP-seq用于转录组范围内研究探索，并筛选目标基因。MeRIP-seq技术具有建库简单，技术成熟等优势，微量MeRIP-seq具有建库简单，技术成熟，低起始量等优势。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术，样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需5μg总RNA。
微量MeRIP-seq
MeRIP-qPCR需要结合Input的qPCR结果进行分析，应用方向为后续目标基因的甲基化验证，具有靶基因、准确性更高等优势。
MeRIP-qPCR
7、m6A甲基化数据挖掘思路
m6A甲基化数据挖掘主要有三步：
m6A甲基化图谱分析，整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
差异m6A peak分析，筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
8、m6A甲基化下游实验设计
（1）简单验证
A. 目标基因m6A甲基化的验证：MeRIP-RT-PCR
B. 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
C. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
A. m6A甲基化干扰：m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂
如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2
B. 检测m6A甲基化整体变化：m6A甲基化免疫荧光染色（定性）、m6A斑点杂交（定性）、比色法（定量）、质谱法（定量）
C. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
D. 检测目标基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 检测目标基因蛋白质水平：Western blot
F. 检测细胞功能/表型变化
FB23-2给药后，大脑损伤组神经功能缺陷评分显著变差
（3）靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
A. 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建：荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒，转染细胞并表达。
B. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
C. 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
D. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
E. 检测细胞功能受到的影响:免疫荧光显微观察功能标志物测定... ...
用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统
（4）研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
A. 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平：Polysome profiling、Ribo-seq，通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率
B. 研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平：研究m6A对目标基因mRNA水平的影响——RT-qPCR、RNA-seq
C. 研究m6A是否通过调控RNA的出核（nuclear export）而影响目标基因蛋白水平：裂解细胞，超速离心分离细胞核与细胞质，然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平
（5）m6A修饰目标基因的表达回复实验
A. writers的突变/敲降/敲除实验：RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化、Western blot检测目标基因的蛋白水平变化、检测目标基因的功能
B. writers的突变/敲降/敲除后，目标基因的过表达回复实验：检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响
（6）研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种
Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验：RT-PCR验证靶基因的mRNA水平、Western blot验证靶基因的蛋白水平、Readers的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合
YTHDF1引入突变后，检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否收到影响
