FFPE组织靶向扩增NGS

2021/03/17
靶向NGS的优势：可以使用少量或定性上次优的样本，如福尔马林固定，石蜡包埋的组织

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Amplicon-Based Targeted Next-Generation Sequencing of Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue
日期：2019.01.01

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1、靶向NGS面板设计
2、靶向NGS面板的确认
3、文库准备
4、模板准备
5、测序
6、Ion Torrent 变异调用
7、变异解释和临床报告
8、数据可视化
9、在 Ion Torrent 数据中检测拷贝数扩增

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1、靶向NGS面板设计

设计有限数量的引物池，用于测序特定的外显子或热点基因

• Ion Ampliseq Designer
  一种primer 设计工具，在 Ion Torrent sequencing 中自定义超高多重引物池

• 实验起始材料
  FFPE：检测来自FFPE材料的DNA，由于分离DNA的碎裂性质，扩增子应该很小，建议为140-160bp。

• 在测序整个基因或基因区域的情况下，覆盖外显子-内含子边界位点的外显子填充应至少为25bp。 虽然将增加面板的目标区域大小，但将允许识别假定的剪接变异区域。

• 输入：
  （1）特定的基因组位置（作为区域进行输入）：将特定的突变热点添加到设计中
  （2）基因完整的编码序列（GENE_CDS）
  （3）不包括UTR区域的编码序列（GENE_EXONS）

  
  输入界面

• 提交设计后，可以通过导入Broad Institute开发的Integrative Genomics Viewer(IGV)中的.bed文件来下载和查看结果

• 设计优化

• 在384孔板选择接收所有单个引物对

2、靶向NGS面板的确认

应使用与常规测试质量相似的DNA靶扩增来评估面板的性能。

• 模板库合成协议 不知道是什么
• 必须在IGV中评估每个扩增子的性能，所需的覆盖范围和伪影
• 靶向NGS测序在检测PCR或测序错误方面极其敏感。替换是在PCR或测序过程中通过错误的碱基掺入引入的，并在扩增中随机发生。
• 对有代表性的扩增子进行彻底的人工检查来评估假阳性替换的频率。
• 所需的覆盖范围受所使用的材料的影响；在肿瘤百分比较高的样本中，可以期望较高的变异等位基因分数(VAF)。

3、文库准备

• Ion AmpliSeq Library kit 2.0
• 对每个分离的DNA样本分别进行目标扩增（每个引物池>10ng）之后，引物被部分消化
• 接头和条形码接头连接到扩增的目标
• 用Agencourt AMPure XP试剂纯化连接液

• 对完整文库简短扩增后，两步从PCR混合物中纯化扩增出的完整文库
  （1）文库的量化与质量
    法一：利用Qubit实现文库规范化
      》最后的文库在无核酸酶水中洗脱
      》 Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit 测量文库的浓度

  
  NGS工作流的概述

  法二：利用qPCR实现文库规范化
    》基于qPCR进行文库定量时，不需要最终的扩增和随后的纯化步骤，提供了少一
    轮扩增和缩短文库准备时间的优势。
  法三：利用Ion Library Equalizer Kit实现文库规范化
    》若样品输入的质量可能较低，例如来自FFPE材料的DNA，不推荐使用这种方法。
（2）使用一个基因面板的pool策略
  每种类型的Ion Torrent chip都有它能产生的平均读取次数，分析用芯片的确定取决于所需的覆盖范围和分析所覆盖的序列的数量。
  例如，318芯片平均产生6M读取，估计200个扩增子的基因面板的平均覆盖范围应为20万读（每个扩增子1000读）。
（3）使用几个基因面板的pool策略
  重要的是要记住有多少扩增子组成一个基因面板，以及需要每个扩增子的最小平均覆盖范围。
  例如，当汇集两个库时，其中一个库由200个扩增子组成，另一个库由20个扩增子组成，池的比率应该类似于扩增子数目的比率，在这里200：20。

4、模板准备

• NGS库使用 乳液PCR与离子微球颗粒（Ion Sphere particles）耦合和扩增
• 清除空离子微球颗粒
• 将包含文库库的离子微球颗粒加到测序芯片的孔中
  （1）Ion Chef System：模板准备，包括芯片加载
  （2）OneTouch™ 2 system：模板准备的替代协议
  （3）OneTouch2 and OneTouch ES：乳液PCR和富集

5、测序

• 测序 Ion Torrent PGM
• 原始数据处理（对齐方式、覆盖率分析和变异调用）：Torrent Suite，仪器上的软件包
• Torrent Suite一些重要的变量：
  （1）芯片质量特性，如芯片加载（优选>90%）和 活离子球粒子数的划分（>90%）分析，多克隆性（<30%），其余的离子球体粒子ISPs会产生可用的读取数。
  （2）通过运行T Torrent Suite Coverage Analysis plugin来报告库特定的质量度量，这个插件将返回一些指标，例如：关于目标百分比，在目标区域内的数据的百分比、平均覆盖率、每个扩增子的平均覆盖率、均匀性、文库中所有扩增子的序列一致性、扩增子是否被相同覆盖。
  （3）扩增子直方图，提供了文库的性能指标，并可以识别由于输入材料质量差，在文库准备过程中纯化不足，或测序较差导致的不完全扩增

6、Ion Torrent 变异调用

• Torrent Variant Caller (TVC)：Ion Torrent™ Sequencing platform一个遗传变异caller
• 识别单核苷酸变异( single-nucleotide variants，SNV)、多核苷酸变异( multinucleotide variants，MNV)、插入、缺失和嵌块取代（ block substitutions）
• FFPE样本：应用somatic_high_stringency参数（基于TVC设置模板ccp_somatic_highstringency_pgm_parameters.json），根据以下值进行了调整：allow_complex和 allow_mnps，两者均设置为1。
• 需要BAM文件、一个目标区域和热点文件。
  （1）目标区域文件：序列仅限于在感兴趣区域文件中出现的指定染色体区域
  （2）热点文件：TVC评估基因组上列出的每个位置，并报告每个热点位置的筛选指标，包括不被称为变异的位置。当一个热点位置时在接收到NOCALL而不是引用调用或变体调用时，VCF输出文件中的过滤原因会解释生成NOCALL的原因

7、变异解释和临床报告

• TVC产生xls文件
• Ensembl API 添加注释：变异效应分数和预测，结果类型 (e.g., missense, stop gained,frameshift, and splice region)，参考其他数据库 (e.g.,Unigene, RefSeq, OMIM, and Cosmic)，该转录本的生物类型(e.g., protein coding)，由该变异引起的氨基酸变化，基因描述。
  （1）内含子中第一个或最后两个碱基中的变异被认为是潜在的剪接位点改变变体。 （2）synonymous, 5' and 3' UTR and intronic variants 将被过滤
  （3）等位基因部分<5%或平均覆盖率<100X的变异体被过滤，这一类的变体很可能是FFPE过程中固有的固定伪影。在新鲜冷冻样品中，没有看到大量的这些变异，尽管设置3%的等位基因分数截止，以避免假阳性结果。
  （4）合并要排除的已知变体的列表(based on public databases dbSNP, 1000 Genomes, and GoNL)过滤生殖系变异
  变体的数据库视图的示例
  一种变体的IGV图像(KRAS，c.183A>C，p.Q61H)

8、数据可视化

• Torrent Suite在服务器上本地存储.vcf文件，包含有关变异位置和变异频率的所有信息。将这些变体与dbSNP、ENSEMBL和COSMIC等在线数据库进行比较，以筛选出良性变体。

• BAM文件可以从Torrent套件下载并加载到像IGV这样的可视化工具中，以清晰的视觉方式探索序列数据

  
  igv

• 还可以导入带有基因面板目标位置的.bed文件，以简化对目标区域的搜索。

9、在 Ion Torrent 数据中检测拷贝数扩增 （完全不懂）

基因面板中扩增子的Z分值分析。 对于基因面板中的每个基因，所有扩增子的Z分值都在一个单独的图表上描述。 对于每个图，Z分被描述在Y轴上，相应基因的不同扩增子在X轴上表示。 表示放大的Z分数用蓝色表示。 用于位于1号染色体上的ERBB2基因所有3个扩增子的Z分值均高于10，表明ERBB2扩增

不懂

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材料：

DNA Isolation
LibraryPreparation
TemplatePreparation